性粉剂800倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度80%的荫棚,保持空气相对湿度的80%~90%。如发现有病死植株,及时拔除。每处理5盆,每盆种5株,重复3次,移栽3个月后考察成活株数,并进行数理统计分析。
2 结果
2.1 无菌繁殖体系的建立 实验表明,外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在,顶端优势表现较为强烈,因而以生长为主,不定芽发生较少,平均芽增殖数为0.6个;中段茎不定芽发生快、量大、长势好,平均芽增殖数为4.05个,并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化,虽有不定芽发生,但发生量与生长势均较弱。
从实验中观察到,不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15~20 d后,茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大,芽丛在节的四周萌出,起初为白色略带黄色,随着培养时间加长,芽不断伸展,逐渐转为黄绿色,形成主芽。叶腋芽是单生的,极个别节上能对生两个腋芽,未发现茎部或切口处长出不定芽。培养30 d左右,主芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽),45 d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽,随着芽的生长、出现叶片,节处毛并产生根,外被浓密的白色绒毛,从而形成完整小植株。培养3个月后每天观察,侧芽分生组织的增殖,一般只出现主芽和一二级侧芽或苗;培养5个月以上,主芽、侧芽较高,叶片较多、大,只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗,随培养时间或继代繁殖代数的增加,或激素的作用,芽或苗因节间短,多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中,未见愈伤组织,也没有发现有原球茎和类原球茎产生。
2.2 不定芽诱导
2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的影响 以金线莲的茎节段作为外植体,腋芽能快速萌发出不定芽体。经60 d的培养,增殖倍数可达3.1~5.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响,MS,B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍,比其它培养基增加23.8%~74.2%。
经LSR差异显著性测定,MS,B5培养基之间无明显差异,与1/2MS,KC和VW之间存在极显著差异,且MS,B5培养基上诱导产生的不定芽色绿、粗壮,表明MS,B5培养基适合作为金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基。
2.2.2 激素对不定芽诱导的影响 激素种类、水平与配比对组织培养快速繁殖在效率存在明显的影响,6-BA、KT和NAA是3种常用生长调节剂,其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。同为细胞分裂素的6-BA,KT在相同的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著,
6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%,表明6-BA比KT更适合金线莲茎节不定芽的诱导。 6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于4.0 mg/L的情况下,随浓度的提高,不定芽增殖率明显上升,添加量为4.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0,1.0 mg/L分别提高22.1%和47.6%。当6-BA添加量达到6.0 mg/L时,其增殖率还出现下降趋势,表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0 mg/L。
生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进作用。可以看出,添加了NAA的培养基不定芽增殖量与生长明显较不添加的好,芽体粗壮、色浓绿,其中添加0.5 mg/L的表现最好,添加1.0 mg/L的其次,但二者间差异未达到显著水平;与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试验条件下NAA适宜添加的量为0.5~1.0 mg/L。
2.3 壮苗培养
2.3.1 激素对幼苗生长的影响 在金线莲壮苗培养中,NAA较6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。NAA浓度低于3 mg/L时,对幼苗生长有促进作用,随浓度的增加,叶片净增量、发根数和鲜重净增量明显增加,当浓度达到4.0 mg/L时,叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA在0.5 mg/L情况下,比不加的具有一定的促进作用,但未达显
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