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JIPB | 福建农林大学顾连峰课题组开发利用竹花叶病毒作为载体探究竹子功能基因的技术体系

花匠小妙招
2024-10-10 06:55

禾本科竹子在开花调控和竹笋快速生长等方面具有独特的生物学特性，毛竹和麻竹作为散生竹和丛生竹的代表, 二者染色体水平的基因组序列 (Peng et al. 2013; Zheng et al. 2022) 和探究功能基因的传统稳定遗传转化体系均有报道 (Qiao et al. 2014; Ye et al. 2017; Ye et al. 2020; Huang et al. 2022) ，这为用竹子作为反向遗传研究材料进行分子水平研究提供了极大的便利。但由于稳定遗传转化体系普遍存在效率较低和周期较长等问题, 导致竹子的功能基因研究规模一直受到限制。植物病毒载体已被证明可携带目的基因进入宿主进行表达和翻译, 是研究植物基因功能的有效工具 (Choi et al. 2019; Ma et al. 2020; Fang et al. 2021) 。竹花叶病毒（BaMV）是已知正单链RNA病毒，可侵染多个竹种。BaMV携带外源或内源基因侵染竹子体系却未见报道。如能开发BaMV介导的高效侵染体系将为探索竹子基因功能提供极大的便利。

近日，福建农林大学林学中心顾连峰教授课题组在Journal of Integrative Plant Biology发表了题为Development of an efficient expression system with large cargo capacity for interrogation of gene function in bamboo based on bamboo mosaic virus的研究论文，开发了利用竹花叶病毒作为载体探究竹子功能基因的技术体系。

该研究分别对BaMV的三个不同插入位点外源基因EGFP进行了表达分析, 发现越靠近3’端基因表达越强，引入病毒沉默抑制子P19可以促进ORF4和ORF5之间插入外源片段病毒的传播。病毒载体大多难以携带长片段在宿主中传播表达，为了测试本研究中构建的BaMV载体是否可以携带长片段在宿主中传播表达，将RUBY系统 (He et al. 2020) 与P19以T2A连接后插入病毒载体中，发现BaMV载体在丛生竹麻竹中可以成功表达大片段RUBY系统，叶片和根部都出现大面积红色表型，而且在麻竹中分蘖出来的小苗全株都出现红色表型 (图一) 。

图一在麻竹中通过竹花叶病毒介导进行外源基因(EGFP/RUBY)的表达及表型观察

毛竹作为散生竹的代表其稳定遗传转化要远比丛生竹麻竹困难, 因此探究毛竹功能基因研究的技术体系更为迫切。利用和麻竹相同的侵染方式, 检测到了外源报告基因EGFP和RUBY的表达, 同时也分别观察到了绿色荧光和甜菜红素积累的红色表型 (图二) , 说明竹花叶病毒介导的外源基因表达系统同样适用于散生竹毛竹。

图二在毛竹中通过竹花叶病毒介导进行外源基因(EGFP/RUBY)的表达及表型观察

本文不但利用该病毒载体系统成功表达外源基因 (EGFP/RUBY) , 还在麻竹中成功过表竹子自身内源基因ACE1和DEC1，表型观测显示在麻竹中ACE1和DEC1分别起到了促进和抑制赤霉素伸长作用 (图三) 。

图三在麻竹中通过竹花叶病毒介导进行内源基因(ACE1和DEC1)的表达及表型观察

综上，本研究在竹子中开发了基于BaMV可应用的基因表达系统, 并在竹子中获得了肉眼可见的表型, 解决了竹子稳定遗传转化效率低和周期长的问题。特别是该病毒系统可以携带长片段传播表达，为竹子基因功能研究提供了便捷的技术体系。并为在竹子中开发病毒介导的基因编辑体系提供了重要的前期基础。

福建农林大学林学院硕士研究生金炎冬、王柏杰和包明川为论文共同第一作者，福建农林大学林学中心顾连峰教授为论文通讯作者。林学院李宇婕、肖圣武、王玉华、张郡和林学中心张航晓、作物科学学院李明杰副教授以及中兴大学徐尧辉教授也参与了本项目。该研究得到十四五国家重点研发项目、基金委面上项目和福建农林大学林学院高峰学科的支持。

参考文献：

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He Y, Zhang T, Sun H, Zhan H, Zhao Y (2020) A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Hortic Res 7: 152

Huang B, Zhuo R, Fan H, Wang Y, Xu J, Jin K, Qiao G (2022) An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science 13:

Ma X, Zhang X, Liu H, Li Z (2020) Highly efficient DNA-free plant genome editing using virally delivered CRISPR–Cas9. Nature Plants 6: 773-779

Peng Z, Lu Y, Li L, Zhao Q, Feng Q, Gao Z, Lu H, Hu T, Yao N, Liu K (2013) The draft genome of the fast-growing non-timber forest species moso bamboo (Phyllostachys heterocycla). Nature genetics 45: 456-461

Qiao G, Yang H, Zhang L, Han X, Liu M, Jiang J, Jiang Y, Zhuo R (2014) Enhanced cold stress tolerance of transgenic Dendrocalamus latiflorus Munro (Ma bamboo) plants expressing a bacterial CodA gene. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 50: 385-391

Ye S, Cai C, Ren H, Wang W, Xiang M, Tang X, Zhu C, Yin T, Zhang L, Zhu Q (2017) An Efficient Plant Regeneration and Transformation System of Ma Bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) Started from Young Shoot as Explant. Front Plant Sci 8: 1298

Ye S, Chen G, Kohnen MV, Wang W, Cai C, Ding W, Wu C, Gu L, Zheng Y, Ma X, Lin C, Zhu Q (2020) Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant biotechnology journal 18: 1501

Zheng Y, Yang D, Rong J, Chen L, Zhu Q, He T, Chen L, Ye J, Fan L, Gao Y, Zhang H, Gu L (2022) Allele‐aware chromosome‐scale assembly of the allopolyploid genome of hexaploid Ma Bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Journal of Integrative Plant Biology 64: 649-670

论文链接：

https://doi.org/10.1111/jipb.13468