一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

• 花匠小妙招
• 2025-10-30 09:26

本发明属于生物纳米材料领域，具体涉及一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。

背景技术：

核酸特有的沃森-克里克碱基配对特性，使其可作为构建各种纳米结构的元件。相比于传统纳米材料，核酸纳米材料具有序列可编程性、自动控制合成、稳定性高以及其本身的功能，从而广泛用于生物医疗、生物技术和纳米电化学中。

常见的核酸纳米结构如多面体、核酸纳米粒子、核酸纳米管、dna折纸等，这些构建核酸纳米结构的方法均依赖于短的核酸链之间的沃森-克里克碱基配对，然而，这些方法也存在一些缺点，如需要对核酸链进行复杂的设计，需制备大量的核酸链，核酸链间的空间位阻导致其结构不紧密，切口的存在使其易被核酸酶降解，变性等条件会导致其结构的解离从而破坏纳米结构的完整性。因此，需要一种不依赖于沃森-克里克碱基配对作用，只需少量的不含有切口的核酸链来构建堆积紧密、多功能化的核酸纳米结构。

dna纳米花是一种紧密堆积的非典型的层级的自组装结构，不依赖于沃森-克里克碱基配对，在无机焦磷酸镁的存在下，利用dna链与焦磷酸镁之间的相互作用，通过dna液体结晶化、各向异性的有序组装而形成高浓度的多聚体。紧密堆积的dna纳米花可用于装载各种功能基团，如药物和成像物质等，纳米花的形貌大小对于其应用具有重要作用。因此，对于纳米花形貌的调控的研究十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。

为了实现本发明的目的，利用oxyethyleneglycolbridge修饰引物通过pcr扩增获得的5’端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%；进而通过调节双链功能核酸扩增子浓度、mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控。此外，利用功能核酸纳米花优良的比表面积和核酸特异性，实现了功能核酸纳米花高效捕获单链核酸靶标。

第一方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的组装方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行pcr扩增获得扩增子，对所述pcr扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；

所述的化学修饰的核酸引物为上游引物1seqidno:1（序列中n代表oxyethyleneglycolbridge）和下游引物1seqidno:2（序列中n代表oxyethyleneglycolbridge）；

具体的，上游引物seqidno:1：

5’-ggggggaagagggaaggtt-oxyethyleneglycolbridge-ttgtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’；

具体的，下游引物seqidno:2：

5’-ggggggaagagggaaggtt-oxyethyleneglycolbridge-tttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

所述的化学修饰为oxyethyleneglycolbridge，具体结构为：

所述纯化方法为去除pcr扩增体系中的蛋白质、盐等非pcr产物；

优选地，纯化方法采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(dp204-02)对扩增产物进行纯化；

所述纯化子孵育是在30℃的金属浴中孵育18h进行高效组装，其中孵育体系是159μlddh2o,20μl10×pcrbuffer(mg2+plus)，17μlmg2+(100mm),2μlppi(100mm)，2μlpcr纯化子。

随后，使用冷冻离心机于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清；加入20μl去离子水充分洗涤，于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后晾干过夜，通过扫描电镜观察双链功能核酸纳米花的形貌。

第二方面，本发明利用双链功能核酸纳米花对tris-hclbuffer(ph5.0)不耐受，将制备好的纳米花样品使用tris-hclbuffer(ph5.0)中进行溶解，建立双链功能核酸纳米花的核酸定量分析方法；

所述定量分析方法，首先使用10倍梯度稀释的纯化pcr扩增子(浓度为95.218ng/μl)为扩增模板，进行realtimepcr的定量分析,superrealpremixplus(sybrgreen)(fp205天根生化科技(北京)有限公司)，pcr过程选用了25μl的pcr扩增体系，组分如下：

其中，使用的上游引物2seqidno:3与下游引物2seqidno:4的序列分别为：

上游引物seqidno:3：5’-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’

下游引物seqidno:4：5’-tcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’

实验得到的realtimepcr的扩增曲线，并依据其ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y=-4.553x+16.507。

标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的tris-hclbuffer(0.05mm,ph5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为realtimepcr的扩增模板，使用上游引物seqidno:3与下游引物seqidno:4作为realtimepcr的扩增引物(pcr扩增体系同上)，进行realtimepcr。通过测定的ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。

第三方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行pcr扩增获得扩增子，用所述pcr扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；

所述纯化子的浓度范围在1.00pg/l~200μg/l；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的纯化子浓度为：95.218pg/l~95.218μg/l；

所述mg2+浓度范围在0.10~20mm；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的mg2+浓度为：2.5~10mm；

所述焦磷酸根浓度范围在0.01~5.00mm；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的焦磷酸根浓度为：0.25~1.0mm。

第四方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的应用，将预先合成的双链功能核酸纳米花喷涂在硝酸纤维素膜上，然后通过侧流层析作用捕获特定的单链核酸；

所述单链核酸通过羧氨反应偶联标记在磁珠上；具体的，氨基修饰的核酸序列，其序列如seqidno:5所示，具体为：5’-ggggggaagagggaaggggtggtgggtttt-nh2-3’。

所述捕获方法是通过观察硝酸纤维素膜上是否有棕色的条带，判断功能核酸纳米花捕获磁珠偶联的单链核酸。

另一方面，本发明的双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法在纳米材料合成中的应用以及相应的双链功能核酸纳米花在核酸检测中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明利用oxyethyleneglycolbridge修饰的功能核酸引物进行pcr扩增，扩增后利用带有oxyethyleneglycolbridge修饰的pcr纯化子进行双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%；通过双链pcr纯化子浓度、金属离子浓度、焦磷酸根浓度，实现了双链功能核酸纳米花的形貌转换，为核酸纳米材料在检测领域的应用提供了借鉴。

1．本发明利用oxyethyleneglycolbridge修饰的功能核酸引物进行pcr扩增，其pcr纯化子可以实现双链功能核酸纳米花的组装。

2．本发明公开了一种双链功能核酸纳米花的高效定量组装方法，纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。

3．本发明通过调节双链pcr纯化子的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花可控组装的花瓣密集程度；且纯化子的浓度与纳米花的组装密集程度呈现负相关性。

4．本发明通过调节金属镁离子的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花的花状骨架结构；且镁离子的浓度与纳米花的花状骨架的清晰度呈现正相关性。

5．本发明通过调节焦磷酸根的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花的密集组装程度；且焦磷酸根的浓度与纳米花的密集组装程度呈现正相关性。

6．本发明将组装密集程度适中，形貌良好的功能核酸纳米花喷涂在侧流层析纸基上，证明纳米花能够有效捕获磁珠偶联的单链核酸靶标，为核酸纳米材料在检测领域的应用提供了借鉴。

附图说明

图1为双链功能核酸纳米花的扫描电镜图。(加速电压为10kv；工作距离为9.6mm；利用se2探测器探测；放大倍数为10980倍)。

图2为溶解后的双链功能核酸纳米花的扫描电镜图。(加速电压为10kv；工作距离为7.8mm；利用inlens探测器探测；放大倍数为10700倍)。

图3为pcr扩增子的realtimepcr的扩增曲线。

图4为pcr扩增子的realtimepcr的标准曲线。

图5为带有oxyethyleneglycolbridge化学修饰的双链pcr纯化子的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。

图6为金属镁离子的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。

图7为焦磷酸根的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。

图8为功能核酸纳米花喷涂在试纸上捕获磁性单链核酸的显色结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1双链功能核酸纳米花的可控组装

dntps、rtaqdna聚合酶、10×pcrbuffer购自takara公司，dna纯化试剂盒dp204-02购自天根生化科技（北京）有限公司,mgcl2·6h2o、k4p2o7溶液级别为分析纯。

培养沙门氏菌后，使用试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对细菌基因组dna进行基因组提取，以沙门氏菌基因组作为扩增模板，上游引物seqidno:1与下游引物seqidno:2对基因组进行扩增。

其中，上游引物1seqidno:1与下游引物1seqidno:2的序列分别为：

上游引物1seqidno:1：5’-ggggggaagagggaaggtt-oxyethyleneglycolbridge-ttgtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’

下游引物1seqidno:2：5’-ggggggaagagggaaggtt-oxyethyleneglycolbridge-tttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

且隔断引物中隔断物为oxyethyleneglycolbridge，其结构为：

扩增程序为：98℃5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃降温。

双链pcr扩增子的产物纯化过程使用了50μl的pcr扩增体系，使用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(dp204-02)对扩增产物进行纯化，随后使用nanodrop分析得到pcr纯化子的浓度为95.218ng/μl。

双链功能核酸纳米花于30℃的金属浴中孵育18h进行高效组装，体系组分如下：

随后将样品置于4℃预冷的冷冻离心机中，12000rpm离心30min。仔细观察微量沉淀，缓慢、小心地吸净上清，保留沉淀，然后滴加40μlddh2o，涡旋振荡，再次于4℃预冷的冷冻离心机离心，12000rpm离心30min。以上洗涤过程重复两次，将样品置于30℃金属浴中过夜晾干。利用扫描电镜观察到纳米花的形貌，发现纳米如图1所示。

实施例2双链功能核酸纳米花的核酸定量分析

由于双链功能核酸纳米花对tris-hclbuffer(ph5.0)不耐受，因此实验对双链功能核酸纳米花的溶解过程进行了形貌验证。将制备好的纳米花样品使用0.05mm的tris-hclbuffer(ph5.0)在37℃的细胞培养箱中孵育24h后，利用扫描电镜观察到纳米花的形貌，发现纳米花几乎消失，扫描电镜图见图2。即可以获得功能核酸纳米花的双链核酸。

接下来建立标准曲线。使用10倍梯度稀释的纯化pcr扩增子(浓度为95.218ng/μl)为扩增模板，进行realtimepcr的定量分析(天根生化科技(北京)有限公司,superrealpremixplus(sybrgreen)(fp205))，pcr过程选用了25μl的pcr扩增体系，组分如下：

其中，使用的上游引物2seqidno:3与下游引物2seqidno:4的序列分别为：

上游引物2seqidno:3：5’-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’

下游引物2seqidno:4：5’-tcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’

实验得到的realtimepcr的扩增曲线见图3，并依据其ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y=-4.553x+16.507(图4)。标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的tris-hclbuffer(0.05mm,ph5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为realtimepcr的扩增模板，使用上游引物seqidno:3与下游引物seqidno:4作为realtimepcr的扩增引物(pcr扩增体系同上)，进行realtimepcr。通过测定的ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。

实施例3双链功能核酸纳米花的形貌调控

首先用带有oxyethyleneglycolbridge化学修饰的双链pcr纯化子的浓度对核酸纳米花形貌调控的验证，即核酸纯化子的终浓度依次为95.218μg/l，95.218ng/l，95.218pg/l，然后与10mmmg2+，终浓度为1.0mm的k4p2o7在30℃金属浴中孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用geminisem300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。

具体的孵育体系如下：

实验结果表明，在焦磷酸根浓度、金属离子种类和浓度一定时，随着核酸浓度的减小，核酸纳米花的粒径逐渐增大，且花瓣数随之增加（图5）。

其次，验证mg2+浓度对核酸纳米花形貌的调控。固定k4p2o7的终浓度为1.0mm，核酸纯化子的终浓度为原核酸纯化子稀释1000倍，即95.218μg/l，改变金属离子的浓度：mg2+浓度分别选取2.5mm，5mm，10mm，分别于30℃金属浴孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用geminisem300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。

具体的mg2+孵育体系如下：

实验结果表明，当mg2+浓度为2.5mm时，核酸纳米花的形状为海绵状球体，当mg2+浓度依次为5mm，10mm，核酸纳米花的形状为球体，10mm时花状骨架更加明显（图6）。

最后，研究焦磷酸根浓度对核酸纳米花形貌的调控。

固定金属离子为mg2+，终浓度为10mm，核酸终浓度为95.218μg/l，焦磷酸根浓度依次为0.25mm、0.50mm、1.0mm，分别于30℃金属浴孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用geminisem300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。

具体的焦磷酸孵育体系如下：

实验结果表明，在金属离子种类和浓度、核酸浓度一定时，随着焦磷酸根浓度的增加，核酸纳米花的组装逐渐密集，花瓣数逐渐增加（图7）。

实施例4双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸

1.单链核酸的磁珠偶联标记

（1）试剂配制：分别称取50mg的edc与50mg的nhs，使用25mm的mes(2-(n-吗啉)乙磺酸，ph6.0)buffer溶解成终浓度为50mg/ml的溶液，4℃避光储存，备用。

（2）磁珠洗涤：取50μl的羧基修饰磁珠(10mg/ml)，分别使用500μl的25mmmesbuffer洗涤3次后，使用180μl的mesbuffer(25mm)重悬；

（3）磁珠活化：200μl活化体系，于37℃的金属浴中震荡活化1h；

（4）磁珠洗涤：磁分离去除上清，分别使用500μl的25mmmesbuffer洗涤3次后，使用198μl的mesbuffer(25mm)重悬,然后加入2μl的氨基修饰核酸(100μm)。其中，氨基修饰核酸的序列seqidno:5为：5’-ggggggaagagggaaggggtggtgggtttt-nh2-3’

（5）磁珠偶联：200μl偶联体系，于室温下翻转震荡偶联3h以上；

（6）磁珠洗涤：磁分离去除上清，分别使用500ml的25mmmesbuffer洗涤3次后，磁分离去除上清；

（7）磁珠重悬：使用50μl的复溶液(20nmna3po4·12h2o，5%bsa，0.25%tween-20,10%蔗糖)将修饰后的磁珠重悬为10mg/ml，4℃贮存一周后备用；

2.纳米花的制备：

dntps、rtaqdna聚合酶、10×pcrbuffer购自takara公司，dna纯化试剂盒dp204-02购自天根生化科技（北京）有限公司,mgcl2·6h2o、k4p2o7溶液为分析纯。

培养沙门氏菌后，使用细菌基因组dna提取试剂盒进行基因组提取，以沙门氏菌基因组作为扩增模板，上游引物seqidno:6与下游引物seqidno:7对基因组进行扩增。

其中，上游引物3seqidno:6（序列中n代表oxyethyleneglycol）与下游引物3seqidno:7（序列中n代表oxyethyleneglycol）的序列分别为：

上游引物3seqidno:6：5’-acccaccaccccttccctcttcccccctt-oxyethyleneglycolbridge-ttgtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’,

下游引物3seqidno:7：5’-acccaccaccccttccctcttcccccctt-oxyethyleneglycolbridge-tttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

且隔断引物中隔断物为oxyethyleneglycolbridge，其结构为：

双链pcr扩增子的产物纯化过程使用了50μl的pcr扩增体系，使用普通dna产物纯化试剂盒(dp204-02)对扩增产物进行纯化，随后使用nanodrop分析得到pcr纯化子的浓度为95.218ng/μl。

双链功能核酸纳米花于30℃的金属浴中孵育18h进行高效组装，体系组分如下：

扩增程序为：98℃5min，95℃1min，58℃1min，72℃1min，40个循环，72℃10min，4℃降温。

随后将样品置于提前4℃预冷的冷冻离心机中，12000rpm离心30min。

蒸馏水洗涤：仔细观察微量沉淀，缓慢、小心地吸净上清，保留沉淀，滴加40μlddh2o，涡旋振荡，再次于提前4℃预冷的冷冻离心机，12000rpm离心30min。洗涤后仔细观察微量沉淀，小心吸取上清，保留沉淀。以上洗涤过程重复两次后，将样品置于30℃金属浴中过夜晾干。

3.双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸的验证

(1)切纸器处理：将样品垫用切纸器切成20mm×20cm规格、将结合垫切成5mm×20cm规格，将吸水纸切成20mm×20cm规格作为吸收垫。

(2)结合垫的预处理：将结合垫浸于垫处理液（300ml的50mm的boratebufferph8.0）中30min，继而置于室温干燥过夜后存放于干燥环境中。

(3)划线机划线：将每份隔断纳米花样品溶解于20μl的pbsbuffer中(添加有0.25%浓度的海藻糖)，用试纸条划线仪以1μl/cm的速度喷涂在硝酸纤维素膜（25mm×30cm）上，将喷涂完检测线的硝酸纤维素膜于37℃的烘箱中干燥3h，之后将其储存于4℃的冰箱中。

(4)pvc底板组装：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫均按照一定的叠加顺序组装于一个pvc背板（60mm×30cm）上，每部分之间留出2mm的重叠宽度来保证溶液能够在层析试纸上流通顺畅。

(5)切条机切条：用可编程切条器将组装好的核酸侧流层析传感器切成3mm宽度的成品。

(6)双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸的验证：将磁珠偶联的单链核酸滴加试纸条的结合垫上，将试纸条的样品垫竖直浸在runningbuffer（4×ssc+2%bsa+0.05%tween-20）中，观察nc膜上是否有棕色的条带出现。

结果如图8所示，可以发现检测线出现棕色条带，这表明纳米花成功捕获了磁珠偶联的单链核酸。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

<130>s010210617028y

<160>7

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