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玫瑰花标准汤剂制法、特征图谱及含量测定方法与流程

花匠小妙招
2025-10-30 09:46

1.本发明涉及药品技术领域，尤其是玫瑰花加工领域，具体涉及一种玫瑰花标准汤剂制法、特征图谱及含量测定方法。

背景技术：

2.玫瑰花为蔷薇科植物玫瑰rosa rugosa thunb的干燥花蕾，收载于中国药典2015年版一部。具有行气解郁，和血，止痛功能；用于肝胃气痛，食少呕恶，月经不调，跌扑伤痛等。玫瑰主产于山东，甘肃，内蒙古，安徽等地，在我国约有二千多年的栽培历史。玫瑰花是一种具有较高经济价值和药用价值的植物，现代化学研究表明除含有大量挥发油外，还含有黄酮类、有机酸类和鞣质类等物质，并具有扩张心血管，促进血液循环，降血糖，抗肿瘤，抗菌，抗氧化等作用。目前玫瑰花的提取方法很多，申请号为201310105260.0的发明专利中提及一种利用罐式超声波设备提取玫瑰花提取物的方法：将玫瑰花花瓣阴干后破碎，与有机溶剂混合，置于罐式超声提取机中进行提取，去除渣料后，置于动态循环低温蒸发浓缩器中，回收溶剂，得到玫瑰花提取物。

技术实现要素：

3.本发明人认为，中国药典2015年版一部没有针对玫瑰花标准汤剂的含量测定及指纹图谱，这不利于玫瑰花的质量控制。中药色谱特征图谱用于中药的质量控制，能够提供较为丰富的信息，因此本实验开展了玫瑰花标准汤剂的特征图谱研究。经过研究，建立了玫瑰花标准汤剂的特征图谱，可为产品提供质量控制手段。玫瑰花的化学成分主要有挥发油、黄酮类、多酚类、色素类等，经质谱数据显示，玫瑰花标准汤剂中鞣花酸含量最高，鞣花酸是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物，属于多酚类化合物，据报道，其具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等多种药理作用。建立鞣花酸含量测定方法对于控制玫瑰花标准汤剂的质量有重要的参考价值。
4.即，本发明解决的技术问题是：现有技术缺乏玫瑰花标准汤剂及其含量测定和指纹图谱，不利于玫瑰花新饮片如配方颗粒的质量控制，亟需建立玫瑰花标准汤剂的特征图谱和含量测定方法，以控制玫瑰花相关产品的质量。
5.为解决上述技术问题，本发明将玫瑰花饮片加水煎煮两次后，过滤，将滤液浓缩成浸膏，冷冻干燥后得到玫瑰花标准汤剂。经过研究，建立了玫瑰花标准汤剂的特征图谱和鞣花酸含量测定方法。
6.具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
7.一种玫瑰花标准汤剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
8.(1)向玫瑰花饮片中加入水，浸泡，煮沸后保持微沸状态，过滤，滤液冷却；
9.(2)向步骤(1)所得滤渣中加入水，煮沸后保持微沸状态，过滤，滤液冷却，合并两次滤液；
10.(3)将滤液浓缩成浸膏；
11.(4)将浸膏放入冻干机中，经预冻、升华干燥和解析干燥过程后，得到玫瑰花标准汤剂。
12.优选的，上述制备方法中，步骤(1)中，所述水的用量浸过玫瑰花饮片2～5cm，优选为4～5cm；步骤(2)中，所述水的用量浸过滤渣2～5cm，优选为4～5cm。
13.优选的，上述制备方法中，所述步骤(1)中，保持微沸状态的时间为60-90min，优选为80～90min；步骤(2)中，保持微沸状态的时间为45-75min，优选为60～75min。
14.优选的，上述制备方法中，步骤(3)包括下述步骤：
15.将滤液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩成浸膏，玫瑰花饮片与浸膏的比例为1g：2ml，出膏率为25.02％；其中，浓缩过程的温度为60-65℃，真空度为-0.080～-0.090mpa。
16.优选的，上述制备方法中，，所述预冻过程的温度为-45℃，预冻时间为240-300min；升华干燥温度为-30℃～0℃，升华干燥时间为885分钟，真空度为0.2mbar；解析干燥温度为5℃～10℃，解析干燥时间为445分钟，真空度为0.2mbar。
17.优选的，上述制备方法中，所述升华干燥的过程包括下述步骤：调节真空度为0.2mbar，先将温度调节为-30℃，升温速率为1℃/min，维持420min；再将温度调节为-20℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为-10℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为0℃，升温速率为1℃/min，维持180min。
18.优选的，上述制备方法中，所述解析干燥的过程包括下述步骤：调节真空度为0.2mbar，先将温度调节为5℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为15℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为25℃，升温速率为1℃/min，维持180min。
19.本发明还提供一种玫瑰花标准汤剂，由上述方法制备得到。
20.优选的，上述标准汤剂中，所述标准汤剂的鞣花酸含量为2％～3.5％，鞣花酸转移率为150％～200％。
21.本发明还提供上述玫瑰花标准汤剂在食品、保健食品和药品中的应用。
22.本发明还提供一种玫瑰花标准汤剂特征图谱，其特征在于，所述特征图谱呈现4个特征峰，分别为峰1、峰2、峰3和峰4，以峰3为参照峰，各特征峰的相对保留时间在规定值的10％之内，规定值为：
23.峰1：0.242，峰2：0.569，峰4：1.150。
24.优选的，上述玫瑰花标准汤剂特征图谱中，以峰3为参照峰，各特征峰的相对面积为：
25.峰1：0.023～0.045，峰2：0.107～0.170，峰4：0.018～0.055。
26.本发明还提供一种玫瑰花标准汤剂特征图谱的建立方法，其特征在于，包括下述步骤：
27.(1)以鞣花酸为参照物，制备参照物溶液；
28.(2)制备玫瑰花标准汤剂，称取玫瑰花标准汤剂，制备得到玫瑰花标准汤剂供试品溶液；
29.(3)将步骤(1)所得参照物溶液与步骤(2)所得供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到玫瑰花标准汤剂的特征图谱。
30.优选的，上述玫瑰花标准汤剂特征图谱的建立方法中，所述高效液相色谱分析过
程的色谱条件为：色谱柱：agilent zorbax sb-c18，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗涤，进样量为1μl，流速为0.3ml/min，优选为柱温为35℃，，检测波长为254nm。
31.优选的，上述玫瑰花标准汤剂特征图谱的建立方法中，所述梯度洗涤的条件为：
32.0-34分钟，流动相a的体积分数变化为5
→
11.5％，流动相b的体积分数变化为95
→
88.5％；
33.34-40分钟，流动相a的体积分数变化为11.5
→
12％，流动相b的体积分数变化为88.5
→
88％；
34.40-45分钟，流动相a的体积分数变化为12
→
20％，流动相b的体积分数变化为88
→
80％；
35.45-45.1分钟，流动相a的体积分数变化为20
→
5％，流动相b的体积分数变化为80
→
95％；
36.45.1-48分钟，流动相a的体积分数变化为5-5％，流动相b的体积分数变化为95-95％。
37.优选的，上述玫瑰花标准汤剂特征图谱的建立方法中，所述供试品溶液通过包含下述步骤的方法制备得到：
38.取玫瑰花标准汤剂，研细，取0.20g～0.30g，称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20～30ml，称定重量，超声处理或加热回流30～50min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
39.所述参照物溶液通过包含下述步骤的方法制备得到：
40.取鞣花酸对照品，称定，加甲醇制成每1ml含鞣花酸0.3mg，即得。
41.本发明还提供一种玫瑰花标准汤剂含量的测定方法，其特征在于，包含下述步骤：
42.(1)以鞣花酸为参照物制备参照物溶液：取鞣花酸对照品，称定，加甲醇制成每1ml含鞣花酸15～25ug，即得；
43.(2)制备玫瑰花标准汤剂供试品溶液：取玫瑰花标准汤剂，研细，取约0.1g，称定，置具塞锥形瓶中，加入有机溶剂45～55ml，称定重量，回流处理50～70分钟，优选为60分钟，放冷，再称定重量，用有机溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
44.其中，所述有机溶剂选自稀乙醇、75％乙醇、无水乙醇、50％甲醇、80％甲醇或甲醇，优选为80％甲醇；
45.(3)吸取10μl步骤(1)所得参照物溶液与5μl步骤(2)所得供试品溶液分别进行高效液相色谱分析，计算供试品中的鞣花酸含量。
46.优选的，上述玫瑰花标准汤剂含量的测定方法中，所述步骤(3)中高效液相色谱分析过程的色谱条件为：选择agilen zorbax eclipse plus c18色谱柱；柱温：25℃～35℃；以乙腈:0.2％磷酸溶液体积比＝16:84为流动相，流速：0.8～1.2ml/min进行洗脱，检测波长为254nm。
47.本发明的优点是：(1)本发明所述玫瑰花标准汤剂产品水分含量低、出膏率高，鞣花酸含量、转移率高；(2)本发明所述玫瑰花标准汤剂的制备工艺简单，重复性、稳定性好，可大规模生产。(3)本发明建立了玫瑰花标准汤剂的特征图谱，可为产品提供质量控制手段。(4)本发明建立了鞣花酸含量测定方法，对于控制玫瑰花标准汤剂的质量有重要的参考
价值。
附图说明
48.图1为实施例2.1中14批玫瑰花标准汤剂特征图谱的叠加图。
49.图2为实施例2.1中14批玫瑰花标准汤剂特征图谱中峰1相对峰面积的柱形图。
50.图3为实施例2.1中14批玫瑰花标准汤剂特征图谱中峰2相对峰面积的柱形图。
51.图4为实施例2.1中14批玫瑰花标准汤剂特征图谱中峰4相对峰面积的柱形图。
52.图5为实施例2.1玫瑰花标准汤剂对照特征图谱。
53.图6-1为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察部分当甲醇-水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
54.图6-2为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察部分当乙腈-水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
55.图7-1为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察-调整梯度部分当乙腈-水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
56.图7-2为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察-调整梯度部分当乙腈-0.1％甲酸水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
57.图7-3为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察-调整梯度部分当乙腈-0.1％乙酸水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
58.图7-4为实施例2.2中色谱条件的确定-流动相考察-调整梯度部分当乙腈-0.1％磷酸水作为流动相时供试品溶液的uplc图谱。
59.图8-1为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当水为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
60.图8-2为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当95％乙醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
61.图8-3为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当75％乙醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
62.图8-4为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当稀乙醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
63.图8-5为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当甲醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
64.提8-6为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当75％甲醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
65.图8-7为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分当50％甲醇为溶剂时供试品溶液的uplc图谱。
66.图9为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取溶剂考察部分不同提取溶剂的提取效率(峰面积/称样量)对比图。
67.图10-1为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取方式考察部分超声提取时供试品溶液的uplc图谱。
68.图10-2为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取方式考察部分回流提
取时供试品溶液的uplc图谱。
69.图11为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取方式考察部分不同提取方式的提取效率(峰面积/称样量)对比图。
70.图12-1为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取时间考察部分提取15min时供试品溶液的uplc图谱。
71.图12-2为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取时间考察部分提取30min时供试品溶液的uplc图谱。
72.图12-3为实施例2.2中供试品溶液前处理方法的考察-提取时间考察部分提取45min时供试品溶液的uplc图谱。
73.图13为实施例2.2中不同提取时间的提取效率(峰面积/称样量)对比图。
74.图14为实施例2.2中特征峰指认部分玫瑰花标准汤剂的特征图谱。
75.图15-1为实施例2.2中特征峰指认-lc-ms分析结果部分玫瑰花标准汤剂的正离子模式下紫外色谱图。
76.图15-2为实施例2.2中特征峰指认-lc-ms分析结果部分玫瑰花标准汤剂的正离子模式bpi质谱图。
77.图15-3为实施例2.2中特征峰指认-lc-ms分析结果部分玫瑰花标准汤剂的负离子模式bpi质谱图。
78.图15-4为实施例2.2中特征峰指认-lc-ms分析结果部分玫瑰花标准汤剂的负离子模式紫外色谱图。
79.图16为实施例2.2中用lc-ms方法检测出的图15-1中玫瑰花标准汤剂特征峰1的dad紫外吸收图谱。
80.图17为实施例2.2中用特征图谱方法检测出的图14中玫瑰花标准汤剂特征峰1的dad紫外吸收图谱。
81.图18为实施例2.2中用lc-ms方法检测出的图15-1中玫瑰花标准汤剂特征峰2的dad紫外吸收图谱。
82.图19为实施例2.2中用特征图谱方法检测出的图14中玫瑰花标准汤剂特征峰4的dad紫外吸收图谱。
83.图20为实施例2.2中用特征图谱方法检测出的图14中玫瑰花标准汤剂特征峰5的dad紫外吸收图谱。
84.图21为实施例2.2中用lc-ms方法检测出的图15-1中玫瑰花标准汤剂特征峰3的dad紫外吸收图谱。
85.图22为实施例2.2中用特征图谱方法检测出的图14中玫瑰花标准汤剂特征峰6的dad紫外吸收图谱。
86.图23为实施例2.2中用lc-ms方法检测出的图15-1中玫瑰花标准汤剂特征峰4的dad紫外吸收图谱。
87.图24-1为实施例2.2中图15-1中峰1的ms/ms质谱图。
88.图25为实施例2.2中图15-1中峰2的ms/ms质谱图。
89.图26为实施例2.2中图15-1中峰3的ms/ms质谱图。
90.图27为实施例2.2中图15-1中峰4的ms/ms质谱图。
91.图28为实施例2.2中图15-1中峰6的ms/ms质谱图。
92.图29为实施例2.2中图15-1中峰7的ms/ms质谱图。
93.图30为实施例2.2中图15-1中峰8的ms/ms质谱图。
94.图31为实施例2.2中玫瑰花标准汤剂特征图谱与鞣花酸参照物溶液色谱图的对比结果。
95.图32为实施例2.3中不添加玫瑰花标准汤剂的空白溶剂的色谱图。
96.图33为实施例2.3中玫瑰花标准汤剂延长试验结果。
97.图34为实施例3.2中玫瑰花标准汤剂含量测定专属性考察结果。
98.图35为实施例3.2中不同色谱柱耐用性考察hplc图。
99.图36为实施例3.2中不同柱温耐用性考察hplc图。
100.图37为实施例3.2中不同流速耐用性考察hplc图。
具体实施方式
101.鉴于目前市场缺乏玫瑰花标准汤剂及其质量控制手段，本发明提供一种玫瑰花标准汤剂制法、特征图谱及含量测定方法。
102.一种优选的实施方式中，本发明所述玫瑰花标准汤剂的制备方法包括下述步骤：
103.取玫瑰花饮片100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加12倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸50分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2.0ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
104.另一种优选的实施方式中，本发明所述玫瑰花标准汤剂的制备方法包括下述步骤：
105.取玫瑰花饮片100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸90分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加12倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸75分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2.0ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
106.下面通过具体实施例来进一步说明本发明所述玫瑰花标准汤剂制法、特征图谱及含量测定方法。
107.在下面的实施例中，所用的各设备的信息如下表所示：
108.表1实施例所用设备的信息
[0109][0110]
本发明所述玫瑰花饮片即玫瑰花药材，指的是玫瑰花的干燥花蕾，春末复初花将开放时分批采摘，及时低温干燥，水分不超过12.0％，灰分不超过7.0％，鞣花酸含量为0.35％-0.55％。本发明实施例所用玫瑰花饮片同药材，共14批，具体信息如下表所示。饮片批号前也可加bt，例如，bt201801与201801指的是同一批号。
[0111]
表2 14批玫瑰花药材与饮片信息
[0112][0113]
实施例1玫瑰花标准汤剂的制备
[0114]
实施例1.1
[0115]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加12倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸50分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。
[0116]
将所得浸膏在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2.0ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干：进行取出，轧上铝盖，即得玫瑰花标准汤剂冻干粉。其中，玫瑰花真空冷冻干燥机共晶点测试结果为-29.0℃，所述冻干过程为：
[0117]
(1)预冻：预冻温度在60min内调节为-45℃，维持240min。
[0118]
(2)升华干燥：调节冻干机的真空度为0.2mbar，先将温度调节为-30℃，升温速率为1℃/min，维持420min；再将温度调节为-20℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温
度调节为-10℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为0℃，升温速率为1℃/min，维持180min；
[0119]
(3)解析干燥：调节真空度为0.2mbar，先将温度调节为5℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为15℃，升温速率为1℃/min，维持120min；再将温度调节为25℃，升温速率为1℃/min，维持180min。得到玫瑰花标准汤剂冻干粉，即玫瑰花标准汤剂。
[0120]
本发明实施例涉及到的检测方法如下：
[0121]
(1)出膏率
[0122]
出膏率％＝浸膏的质量/玫瑰花饮片的质量
[0123]
(2)鞣花酸含量测定
[0124]
用高效液相色谱法测定标准汤剂和饮片中的鞣花酸含量，色谱条件为：agilen zorbax eclipse plus c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，进样量：5μl；柱温：30℃；以乙腈-0.2％磷酸水(体积比为16:84)为流动相，流速：1ml/min；检测波长为254nm。理论板数按鞣花酸峰计算应不低于1500。具体过程如下：
[0125]
对照品溶液的制备：取鞣花酸对照品(批号：111959-201602，纯度：89.3％，购自中国食品药品检定研究院)适量，精密称定，加纯甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得对照品溶液。
[0126]
供试品溶液的制备：取玫瑰花标准汤剂或玫瑰花饮片1g，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0127]
取对照品溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，计算后得到供试品中鞣花酸含量。
[0128]
(3)鞣花酸转移率
[0129]
鞣花酸转移率％＝玫瑰花标准汤剂中鞣花酸质量/玫瑰花饮片中鞣花酸质量
[0130]
实施例1.2
[0131]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水12倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加10倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸50分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。用实施例1.1相同的冻干方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉。
[0132]
实施例1.3
[0133]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水10倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加8倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸50分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。用实施例1.1相同的冻干方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉。
[0134]
实施例1.1～实施例1.3的加水量及其冻干粉的出膏率如下表所示。
[0135]
表3玫瑰花饮片加水没过药面高度测量结果
[0136][0137]
实施例1.4
[0138]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)50g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加冷水15倍，浸泡30min，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。
[0139]
实施例1.5
[0140]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)50g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加热水15倍，浸泡30min，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。
[0141]
实施例1.6
[0142]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)50g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。
[0143]
实施例1.4～1.6所得冻干粉的出膏率如下表所示。
[0144]
表4不同玫瑰花饮片浸泡方式测量结果
[0145][0146]
由上表可知，玫瑰花饮片无论热水投料还是冷水投料与无浸泡比较，出膏率都不如无浸泡高。
[0147]
实施例1.7
[0148]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸90分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加6倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸75分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的
浸膏。用实施例1.1相同的冻干方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉。
[0149]
实施例1.8
[0150]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加6倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸45分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。用实施例1.8相同的冻干方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉。
[0151]
实施例1.7和实施例1.8所得冻干粉的出膏率如下表所示。
[0152]
表5玫瑰花饮片不同煎煮时间下的出膏率
[0153][0154]
由上表可知，延长煎煮时间，显著提高玫瑰花出膏率。
[0155]
实施例1.9
[0156]
取玫瑰花饮片(饮片批号：201801)100g，置于5l的电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水15倍，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸90分钟，煎液经200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加12倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸75分钟，煎液用200目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至200ml的浸膏。用实施例1.1相同的冻干方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉。
[0157]
实施例1.9所得冻干粉的水分和疏松程度如下表所示。经检测，实施例1.1～实施例1.9所得浸膏粘较稠度，流动性较差，不方便转移和检测，密度为1.035～1.070g/ml，含固量在9.0％-14.2％之间，出膏率在18.5％-30.5％之间，适合冻干。
[0158]
表6实施例1.9所得冻干粉的水分和疏松程度
[0159][0160]
本发明对上述制备工艺的稳定性进行了验证，具体过程如下：
[0161]
实施例1.10
[0162]
取第一批次玫瑰花饮片(批号为：201804)100g，按实施例1.9相同的方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉，重复三次，所得样品分别标记为实施例1.10-1、实施例1.10-2、实施例1.10-3。检测玫瑰花饮片和玫瑰花标准汤剂冻干粉中的鞣花酸含量，计算鞣花酸转移率，结果下表所示。
[0163]
实施例1.11
[0164]
取第二批次玫瑰花饮片(批号为：201815)100g，按实施例1.9相同的方法制备得到玫瑰花标准汤剂冻干粉，重复三次，所得样品分别标记为实施例1.11-1、实施例1.11-2、实
施例1.11-3。检测玫瑰花饮片和玫瑰花标准汤剂冻干粉中的鞣花酸含量，计算鞣花酸转移率，结果下表所示。
[0165]
表7制备工艺稳定性验证
[0166][0167]
由上表可知，每批平行3份玫瑰花标准汤剂水分、出膏率基本一致，鞣花酸含量、转移率相近，说明该工艺稳定可重复，可作为玫瑰花标准汤剂制备工艺。
[0168]
实施例2玫瑰花标准汤剂特征图谱
[0169]
实施例2.1玫瑰花标准汤剂特征图谱的建立
[0170]
按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定玫瑰花标准汤剂特征图谱，具体过程如下：
[0171]
1.仪器与试剂
[0172]
waters acquity/hclass超高效液相色谱仪；empower 3工作站(waters公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；kq-500da型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；hh-4型数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；hy-4调速多用振荡器(金坛市科兴仪器厂)；纯水系统(sartorius公司)。
[0173]
乙腈(色谱纯，thermo fisher公司)；水为超纯水；磷酸(色谱纯，天津市太茂化学试剂厂)；其它试剂均为分析纯。
[0174]
鞣花酸对照品：中国食品药品检定研究院，批号：111959-201602-，含量：89.3％。
[0175]
2.色谱条件
[0176]
色谱柱：agilent zorbax sb-c18。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％磷酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为0.3ml/min；检测波长为254nm。
[0177]
表8梯度洗涤表
[0178][0179]
3.参照物溶液、供试品溶液的制备
[0180]
参照物溶液的制备：取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含鞣花酸0.3mg，即得。
[0181]
供试品溶液的制备：取玫瑰花标准汤剂适量，研细，取约0.24g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45min，放冷，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例1.9的方法制备14批玫瑰花标准汤剂，具体制备工艺参数如表9所示。
[0182]
表9 14批玫瑰花标准汤剂研究汇总表
[0183][0184]
4.特征图谱测定结果
[0185]
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪。上述色谱条件下，测定14批玫瑰花标准汤剂特征图谱，结果如图1所示。其中，峰3为鞣花酸，以峰3为参照峰s，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如下表所示。
[0186]
表10 14批玫瑰花标准汤剂特征图谱相对保留时间
[0187][0188]
表11 14批玫瑰花标准汤剂特征图谱相对峰面积
[0189][0190]
峰1相对峰面积的柱形图如图2所示，峰2相对峰面积的柱形图如图3所示，峰4相对峰面积柱形图如图4所示。
[0191]
由上表和图2-图4可以看出，以峰3(鞣花酸)为参照峰，14批玫瑰花标准汤剂特征图谱的其余3个特征峰相对保留时间rsd值在0.08％～0.78％，均小于3.0％，符合玫瑰花标准汤剂特征图谱的标准要求；14批玫瑰花标准汤剂特征图谱的其余3个特征峰相对峰面积的rsd在12.99％～25.69％，结果表明：不同批次玫瑰花标准汤剂的特征峰对应成分存在一定差异，峰1相对峰面积范围在0.023～0.045，峰2相对峰面积范围在0.107～0.170，峰4相
对峰面积范围在0.018～0.055。
[0192]
为严格控制玫瑰花配方颗粒的质量，为玫瑰花配方颗粒的生产工艺提供更全面的质量控制参数，对玫瑰花标准汤剂特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。由图2～图4的3个特征峰相对峰面积柱形图可以明显看到，各峰的相对峰面积没有明显的离散数据，相对合理。最终根据14批次不同产地玫瑰花标准汤剂的峰1、峰2、峰4的相对峰面积波动范围，考虑14批次不同产地样品的代表性，规定3个特征峰的相对峰面积范围，即：以3号(鞣花酸)为s峰，计算各特征峰与s峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定值为：0.023～0.045(峰1)、0.107～0.170(峰2)、0.018～0.055(峰4)。
[0193]
5.特征图谱的拟定
[0194]
将14批玫瑰花标准汤剂uplc特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》匹配，生成对照图谱，建立玫瑰花标准汤剂对照特征图谱，如图5所示，其中，峰3为参比峰s：鞣花酸。最终确定玫瑰花标准汤剂特征图谱标准为：供试品特征图谱中应有4个特征峰，以3号峰(鞣花酸)为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％之内，规定值为0.242(峰1)、0.569(峰2)、1.150(峰4)；计算各特征峰与s峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定值为：0.023～0.045(峰1)、0.107～0.170(峰2)、0.018～0.055(峰4)。
[0195]
实施例2.2玫瑰花标准汤剂特征图谱分析方法的建立
[0196]
本实施例应用uplc技术，建立玫瑰花药标准汤剂的特征图谱，为其临床用药安全和中药质量控制提供科学依据。
[0197]
试药：表9中的14批玫瑰花标准汤剂冻干粉(bt201801、bt201804、bt201806、bt201808、bt201809、bt201810、bt201811、bt201815、bt201816、bt201817、bt201818、bt201819、bt201820、bt201821)。
[0198]
1.色谱条件的确定
[0199]
参照物溶液的制备：取鞣花酸对照品适量，加甲醇分别配制成每1ml含0.3mg的对照品溶液，摇匀，即得。
[0200]
供试品溶液的制备：取玫瑰花标准汤剂(批号：bt201810)适量，研细。精密称取0.24g，加水25ml，超声处理30分钟，滤过，取续滤液作为供试液。
[0201]
(1)最佳吸收波长的确定
[0202]
记录供试品溶液在210～400nm范围内的吸收光谱。结果表明，在254nm左右，玫瑰花标准汤剂样品溶液可以检测到的色谱峰最多，且各色谱峰的峰面积较大，因此选择254nm为检测波长。
[0203]
(2)流动相的考察
[0204]
①
采用下述洗脱表进行洗脱，考察流动相a-流动相b为甲醇-水或乙腈-水作为流动相时的区别，其他色谱条件参照实施例2.1，检测uplc图谱。
[0205]
表12梯度洗脱表
[0206]
[0207]
不同流动相系统的uplc图谱如图6-1和图6-2所示。对比两者作为流动相时的uplc图谱可知，当甲醇-水作为流动相时，各峰的保留时间较长，当乙腈-水作为流动相时，保留时间较短，峰型更加尖锐。实验结果：由于乙腈-水洗脱能力较强，故选择乙腈-水系统。
[0208]
②
调整梯度，并对加酸和不加酸的情况进行考察。其他色谱条件参照实施例2.1，梯度如表8所示，检测uplc图谱。a为有机相(乙腈)，b为水相(0.1％磷酸水)。
[0209]
对不同流动相酸种类的考察结果如图7-1、图7-2、图7-3和图7-4所示。以乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％乙酸水和乙腈-0.1％磷酸水作为流动相，比较所得uplc图谱可知，当以乙腈-0.1％磷酸水作为流动相时，出峰较多，且峰型更加尖锐。结果表明，乙腈-0.1％磷酸水色谱峰较多且峰型较好，故采用乙腈-0.1％磷酸水进行洗脱。
[0210]
综上所述，最终将色谱条件确定为实施例2.1中的色谱条件。
[0211]
2.供试品溶液前处理方法的考察
[0212]
(1)提取溶剂考察
[0213]
取玫瑰花标准汤剂(批号：bt201810)适量，研细。取约0.24g，精密称定，精密加入水、95％乙醇、75％乙醇、稀乙醇、甲醇、75％甲醇和50％甲醇各25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用不同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0214]
色谱条件参照实施例2.1，检测以水、95％乙醇、75％乙醇、稀乙醇、甲醇、75％甲醇和50％甲醇分别为溶剂时，所得供试品溶液的uplc图谱。提取溶剂考察的uplc图谱如图8-1～图8-7所示，不同提取溶剂的提取效率(峰面积/称样量)对比图如图9所示。分析图谱可知，以水提取的色谱较多，出峰较多，且峰型较好，能明显分辨不同峰的区别，因此选择水作为提取溶剂。
[0215]
(2)提取方式考察
[0216]
考察方法：取玫瑰花标准汤剂(批号：bt201810)适量，研细。取约0.24g，精密称定，加入水溶液25ml，称定重量，分别超声处理、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0217]
色谱条件参照实施例2.1，检测超声处理和加热回流条件下所得供试品溶液的uplc图谱。不同提取方式考察的uplc图谱如图10-1～图10-2所示，不同提取方式的提取效率(峰面积/称样量)对比图如图11所示。分析图谱可知，采用两种不同的处理方式所得的色谱峰数目一致，超声提取与加热回流提取色谱峰响应值相近，考虑到超声处理的操作简捷，最终选择超声处理作为供试液提取方式。
[0218]
(3)提取时间考察
[0219]
考察方法：取玫瑰花标准汤剂(批号：bt201810)适量，研细。取约0.24g，精密称定，加入水溶液25ml，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0220]
色谱条件参照实施例2.1，检测不同超声时间条件下所得供试品溶液的uplc图谱。图12-1、图12-2和图12-3为不同提取时间考察的uplc图谱，图13为不同提取时间的提取效率(峰面积/称样量)对比图。分析图谱可知，超声提取45分钟即可提取完全，最终选择超声处理45分钟。
[0221]
(4)供试品溶液的制备
[0222]
供试品溶液的制备方法：取本品约0.24g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0223]
综上所述，本发明最终确定了实施例2.1中所述供试品溶液的制备过程：取本品约0.24g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)45分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0224]
3.特征峰的指认
[0225]
通过测定不同批次玫瑰花标准汤剂样品的uplc图谱，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择其共有峰。14批玫瑰花标准汤剂的特征图谱如图1所示，由图可知，图中有4个明显的共有峰，积分参数：峰宽为30，阈值800。
[0226]
在实施例2.1关于玫瑰花标准汤剂特征图谱研究中，我们只标定了4个特征峰，后期为了方便与质谱鉴别结果进行比对，我们多标定了几个特征峰，共标定了7个特征峰，如图14所示。采用lc/ms技术，初步鉴定出图14中的4个特征峰(峰1、峰4、峰5、峰6)。
[0227]
(1)实验设备及条件
[0228]
①
uplc条件：
[0229]
waters acquity uplc色谱仪；
[0230]
色谱柱：agilent aq sb-c18色谱柱(2.1*100mm,1.8μm)；
[0231]
流动相系统：乙腈(a)：0.1％甲酸水(b)；按照下表梯度程序洗脱；
[0232]
流速：0.4ml/min；
[0233]
检测波长254，220，210nm；柱温：30℃；进样量：0.8μl(供试品)；0.2μl(对照品)
[0234]
表13梯度提取程序
[0235][0236]
②
质谱条件：waters xevo g2-xs qtof质谱仪，esi离子源正负离子检测；源电压：2.5kv，n2流速：800l/h，碰撞气体为氮气；毛细管温度400℃；锥孔气体流速：100l/h；气源温度：120℃；采用全扫描方式，分子量扫描范围50～1500；碰撞诱导解离电压：6v(低能量)、30～60v(高能量)；
[0237]
③
供试品处理：取玫瑰花标准汤冻干粉1支(批号：201810)，约0.20g，取约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水25ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，放冷，用纯化水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0238]
(2)lc-ms分析结果
[0239]
①
lc-ms质谱轮廓图
[0240]
玫瑰花标准汤剂的lc-ms质谱图如图15-1～图15-4所示，其中，图15-1为254nm紫外色谱图，图15-2为正离子模式bpi质谱图，图15-3为负离子模式bpi质谱图，图15-4为
254nm紫外色谱图。从图15-1所示的254nm紫外色谱图来看，图15-1中的色谱峰1、峰2、峰3、峰4疑似与特征指纹图谱图14中的峰1、峰4、峰5、峰6号峰一致。下面对该4个色谱峰的紫外吸收光谱图及质谱图进行分析。
[0241]
②
各色谱峰的紫外吸收光谱图(200-400nm)：图16-图23为特征峰1-4(附图15-1中的色谱峰1、色谱峰2、色谱峰3、色谱峰4，即附图14中的峰1、峰4、峰5、峰6)的dad紫外吸收对比图。
[0242]
其中，图16、图18、图21和图23分别为lc-ms方法检测出的图15-1中的色谱峰1、色谱峰2、色谱峰3、色谱峰4的紫外吸收光谱图(200-400nm)；图17、图19、图20和图22分别为特征图谱方法检测出的图14中的峰1、峰4、峰5、峰6的紫外吸收光谱图。
[0243]
从紫外吸收光谱图来看，lc-ms方法检测出的峰1、峰2、峰3、峰4与特征图谱发方法对照指纹图谱相应峰一致，本发明分离出的峰1可能是没食子酸，峰2可能是槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷或槲皮素-4
′-
o-吡喃葡萄糖苷，峰3可能是槲皮素-4
′-
o-吡喃葡萄糖苷或槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷，峰4可能是鞣花酸。
[0244]
③
各色谱峰的质谱峰:
[0245]
峰1保留时间1.60min：dad图谱显示出最大吸收峰在219和271nm，图24为峰1的ms/ms(串联质谱，上图中碰撞能量为低能量，下图中碰撞能量为高能量)质谱图，负离子模式下质谱显示，准分子离子峰为169.01404，提示分子量为170，m/z 125.02436为脱去一分子co2形成的碎片离子，提示结构中含有一分子甲酸，综上，该峰1确定为没食子酸。
[0246]
峰2保留时间31.63min，dad图谱显示最大吸收波长为255和353nm，提示为峰2为黄酮类化合物。图25为峰2的ms/ms质谱图，由质谱图显示，m/z 465.10331为其准分子离子峰[m+h]，m/z 303.05011为脱去一份子葡萄糖的苷元准分子离子峰，提示苷元为槲皮素，峰2为槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷或槲皮素-4
′-
o-吡喃葡萄糖苷。
[0247]
峰3保留时间32.95min，由dad图谱显示最大吸收峰再255和351nm处，表明为黄酮类成分；图26为峰3的ms/ms质谱图，正离子模式质谱图显示出与峰2相同的裂解碎片，提示峰3与峰2是取代基位置不同的同分异构体，槲皮素-4
′-
o-吡喃葡萄糖苷或槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷。
[0248]
峰4保留时间34.08min：dad图谱显示最大紫外吸收在253nm处，图27为峰4的ms/ms质谱图，负离子模式下，出现离子峰m/z 300.99859[m-h]，603.00610[2m-h]，表明分子量为300.99859，结合紫外吸收及分子量信息，确定该色谱峰为鞣花酸。
[0249]
峰6的保留时间为38.14min，dad图谱显示最大吸收波长为257和351nm，提示为黄酮类成分。图28为峰6的ms/ms质谱峰，由负离子模式下质谱图显示，m/z 433.07706为其准分子离子峰[m-h]，m/z 301.03406，300.02716为脱去一分子阿拉伯糖[m-h-132]的苷元离子峰，且300.02716离子峰强度大于301.03406峰强度，提示3位取代，因此该色谱峰为槲皮素-3-o-吡喃阿拉伯糖苷。
[0250]
峰7的保留时间为38.56min，dad图谱显示最大吸收波长为264,347nm，提示为黄酮类成分。图29为峰7的ms/ms质谱峰，由负离子模式下质谱图显示，m/z 447.09331为其准分子离子峰[m-h]，m/z 284.03255,285.03910为脱去一分子葡萄糖[m-h-162]的苷元准分子离子峰[aglycon-h]，且离子峰284.03255强度高于285.03910，提示糖连接在3位，因此，峰7鉴定为山奈酚-3-o-β-吡喃葡萄糖苷。
[0251]
峰8的保留时间为38.90min，dad图谱显示最大吸收波长在255和348nm处，图30为峰8的ms/ms质谱峰，负离子模式下质谱图显示，m/z 447.09290为其准分子离子峰[m-h],m/z 300.02717，301.03413为其脱去一分子鼠李糖的苷元准分子离子峰[m-h-146]，因此该峰鉴定为槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖苷。
[0252]
④
峰4的进一步确认
[0253]
由于质谱鉴别色谱条件和特征图谱的色谱条件有差异，为了进一步确认，我们再次用玫瑰花标准汤剂特征图谱的条件进行峰4(鞣花酸)的指认(检测鞣花酸参照物溶液的色谱图)，确定是否与我们分离的峰4保留时间一致，结果如图31所示。
[0254]
将玫瑰花标汤特征图谱中标定特征峰(图14)与质谱鉴定的特征峰(图15-1)进行对比。由图可知，采用lc-ms技术对特征图谱上(图14)的特征峰进行鉴定，鉴定结果表明(图14)的4个特征峰(分别为峰1、峰4、峰5、峰6)分别对应图15-1中的峰1、峰2、峰3、峰4，其它三个特征峰(峰2、峰3、峰7)在图15-1中找不到相对应的色谱峰。玫瑰花标汤特征图谱中标定特征峰(图14)4个特征峰经质谱初步鉴定为峰1可能为没食子酸、峰2可能为槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷、峰3可能为槲皮素-4-o-吡喃葡萄糖苷或槲皮素-3-o-吡喃葡萄糖苷、峰4可能为鞣花酸。由于质谱鉴别色谱条件和特征图谱的色谱条件有差异，为了进一步确认，我们用对照品鞣花酸进样后进行比对，在特征图谱上也找到了相应的色谱峰(峰4)，由于其他三个对照品不易获得，所以暂时未进行比对。所以在特征图谱标定的4个特征峰中，通过质谱鉴定和对照品比对后进一步确定了峰4为鞣花酸。
[0255]
实施例2.3方法学验证
[0256]
1.专属性考察
[0257]
参照实施例2.1的条件，对不添加玫瑰花标准汤剂的空白溶剂进行色谱分析，结果如图32所示，将其与图5比较可知，溶剂对玫瑰花标准汤剂图谱中4个特征峰没有干扰。
[0258]
2.整体性考察
[0259]
参照实施例2.1的条件，将玫瑰花标准汤剂的检测时间延长48min，得到的图谱如图33所示，由图可知，玫瑰花标准汤剂在48min后无明显的色谱峰，整体性较好。
[0260]
3.精密度考察
[0261]
取同一批号样品(批号：bt201810)，按实施例2.1所述供试品溶液制备方法制备成供试液，进样6次，每次1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果如下表所示。
[0262]
表14精密度实验结果(相对保留时间)
[0263][0264]
表15精密度实验结果(相对峰面积)
[0265][0266]
结果表明：各特征峰相对保留时间和相对峰面积rsd均小于3.0％，仪器精密度良好。
[0267]
4.稳定性考察
[0268]
取同一批号样品(批号：bt201810)，按供试品溶液制备方法制备成供试液，每隔几小时进样一次，共测定24小时，分别进样1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果如下表所示。
[0269]
表16稳定性实验结果(相对保留时间)
[0270][0271]
表17稳定性实验结果(相对峰面积)
[0272][0273]
结果表明：各特征峰的相对保留时间和相对峰面积rsd均小于3.0％，供试液在24小时内稳定性良好。
[0274]
5.重复性考察
[0275]
取同一批号样品(批号：bt201810)共6份，按供试品溶液制备方法制备成供试液，进样1μl分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果如下表所示。
[0276]
表18重复性实验结果(相对保留时间)
[0277][0278][0279]
表19重复性实验结果(相对峰面积)
[0280][0281]
结果表明：各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd均小于3.0％，该方法的重复性良好。
[0282]
6.中间精密度考察
[0283]
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪(赛默飞)下操作，取同一批玫瑰花标准汤剂(bt201810)约0.24g，精密称定，平行6份，按实施例2.1所述供试品溶液，按实施例2.1确定的色谱条件，分别进样1μl。以2号峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，实验结果见下表。
[0284]
表20玫瑰花标准汤剂特征图谱中间精密度结果(相对保留时间)
[0285][0286]
表21玫瑰花标准汤剂特征图谱中间精密度结果(相对峰面积)
[0287][0288][0289]
实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，相对保留时间rsd＜3.0％，但相对峰面积略有波动，rsd范围为6.05-14.35％。
[0290]
7.耐用性考察
[0291]
①
不同色谱柱的考察
[0292]
本研究中考察了三种不同填料的色谱柱的分离效果：1-zorbax sb-c18(agilent，2.1
×
100mm，1.8μm)；2-endeavorsil-c18(dikma，2.1
×
100mm，1.8μm)；3-ymc-triart c18(ymc，2.1
×
100mm，1.9μm。
[0293]
结果表明：使用1-zorbax sb-c18(agilent，2.1
×
100mm，1.8μm)色谱峰分离效果较好，因此选择1-zorbax sb-c18(agilent，2.1
×
100mm，1.8μm)进行研究。
[0294]
②
不同柱温的考察
[0295]
用acquity hss t3(waters，2.1
×
150mm，1.8μm)色谱柱，分别考察了柱温为25℃、30℃、35℃时的样品分离效果。结果表明：柱温为35℃时样品的分离效果最好。考虑到色谱柱的寿命，选择柱温为35℃。
[0296]
③
不同流速的考察
[0297]
用zorbax sb-c18(agilent，2.1
×
100mm，1.8μm)色谱柱，分别考察了流速为0.25ml/min、0.30ml/min及0.35ml/min时样品分离效果。结果表明：流速为0.30ml/min时，分离效果好。
[0298]
综上所述，本发明为严格控制玫瑰花配方颗粒的质量，为玫瑰花配方颗粒的生产工艺提供较全面的质量控制参数，建立了玫瑰花标准汤剂特征图谱，并对玫瑰花标准汤剂特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准。本研究基于14批次玫瑰花标准汤剂的充分代表性，取其最大、最小值为依据对相对峰面积进行限量规定；选择鞣花酸峰作为参照峰，计算并规定其他各特征峰的相对峰面积范围，因此建立的各特征峰相对峰面积范围具有的定量性。所建立的峰面积上下限范围具有品种特性，能避免大生产部分合格批次的误判，又能对大生产工艺提供重要质量控制参数，尤其对不稳定的特征峰成分的质量控制，从而提高了产品质量及质量控制水平。
[0299]
研究中，确定了玫瑰花标准汤剂的4个共有峰，并采用lc/ms技术进行特征峰指认，结果在玫瑰花标准汤剂特征图谱中能找到与鞣花酸保留时间一致的特征峰。
[0300]
实施例3玫瑰花标准汤剂含量测定方法
[0301]
实施例3.1鞣花酸含量测定分析方法的建立
[0302]
1.仪器、试剂与试药
[0303]
仪器：赛默菲vanguish(沃特世公司)，agilent 1100(安捷伦公司)，waters arc(沃特世公司)，agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，岛津inertsil ods-hl色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，万分之一天平(梅特勒-托利多公司)，十万分之一天平(赛多利斯科学公司)，超纯水系统(默克股份有限公司，milli-q direct)。
[0304]
试剂：乙醇(重庆川东化工集团有限公司)，甲醇(重庆川东化工集团有限公司)分析纯；液相用85％磷酸(天津市大茂化学试剂厂)、乙腈(默克股份有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)为hplc色谱级，水为实验室超纯水系统(默克股份有限公司，milli-q direct)；
[0305]
试药：鞣花酸(中国食品药品检定研究院，批号：111959-201602-，含量：89.3％)；14批玫瑰花标汤的批号信息见表9。
[0306]
2.色谱条件
[0307]
参考玫瑰花药材含量测定，选择agilen zorbax eclipse plus c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；进样量：对照品溶液：10μl，供试品溶液：5μl；柱温：30℃；以乙腈:0.2％磷酸溶液体积比＝16:84为流动相，流速：1ml/min进行洗脱。
[0308]
3.对照品溶液的制备
[0309]
取鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，即得。
[0310]
4.供试品溶液前处理方法考察
[0311]
对玫瑰花标准汤剂含量测定方法的提取溶剂、提取方式以及提取时间进行考察，确定样品前处理方法。
[0312]
(1)提取溶剂考察
[0313]
取玫瑰花标准汤剂(bt201820)适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行6精密称定，平行6组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入稀乙醇、75％乙醇、无水乙醇、50％甲醇、80％甲醇、纯甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见下表。
[0314]
表22不同提取溶剂玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定结果
[0315]
[0316]
实验结果表明：通过对比6种提取溶剂样品中鞣花酸含量，可发现80％甲醇和水对玫瑰花标准汤剂中鞣花酸的提取率较高，因此选择80％甲醇作为玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定的提取溶剂。
[0317]
(2)提取方式考察
[0318]
取玫瑰花标准汤剂(bt201820)适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见下表。
[0319]
表23不同提取方式玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定结果
[0320][0321]
实验结果表明：通过对比超声与回流两种提取方式的鞣花酸含量，发现回流提取时，玫瑰花标准汤剂鞣花酸的提取率最大，故选择回流作为提取方式。
[0322]
(3)提取时间考察
[0323]
取玫瑰花标准汤剂(bt201820)适量，研细，取约0.1g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇，称定重量，分别回流30分钟、60分钟、90分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见下表。
[0324]
表24不同提取时间玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定结果
[0325][0326]
实验结果表明：通过对比不同回流时间的鞣花酸含量，可发现回流时间为60分钟时，鞣花酸含量最大，因此选取回流时间为60分钟。
[0327]
(4)供试品溶液制备方法的确定
[0328]
根据样品前处理考察实验结果，供试品制备方法可确定为：取玫瑰花标准汤剂适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，回流处理60分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0329]
实施例3.2方法学验证
[0330]
1.专属性考察
[0331]
精密吸取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，将其与鞣花酸对照品溶液与空白溶剂各5μl，注入液相色谱仪，按照实施例3.1中所述色谱条件测定。结果见图34。
[0332]
表25色谱峰分离参数
[0333][0334]
实验结果表明空白溶剂色谱中在与鞣花酸相应的保留时间没有色谱峰，说明溶剂对鞣花酸的测定无干扰，以本法测定玫瑰花标准汤剂中鞣花酸的含量具有专属性。
[0335]
2.峰纯度考察
[0336]
精密吸取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液、鞣花酸对照品溶液各5μl，注入液相色谱仪，按照实施例3.1所述色谱条件以dad检测器进行190nm～400nm扫描检测，计算峰纯度。
[0337]
实验表明，样品中鞣花酸未检测到杂质峰，峰纯度mach匹配值为1000，说明在该色谱条件下，鞣花酸峰纯度符合要求。
[0338]
3.线性考察
[0339]
分别精密吸取鞣花酸对照品溶液(36.82μg/ml)4、6、8、10、12、14、15、16、17μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，鞣花酸进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，结果见下表。
[0340]
表26鞣花酸线性考察结果
[0341][0342][0343]
结果表明，线性回归方程为：y＝609157x+9387.8，相关系数r2＝0.9993，表明在浓度为0.0699μg～0.9087μg的范围内鞣花酸浓度与峰面积线性关系良好。
[0344]
4.精密度考察
[0345]
精密吸取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，按照实施例3.1中所述色谱条件重复进样6次，进样体积5μl。计算峰面积rsd，测定结果见下表。
[0346]
表27精密度考察结果
[0347][0348]
实验结果表明仪器精密度良好。
[0349]
5.稳定性考察
[0350]
精密吸取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，按照实施例3.1中所述色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，20，24小时进样，进样体积5μl，测定供试品溶液中鞣花酸的峰面积，计算峰面积rsd，测定结果见表4-23。
[0351]
表28稳定性考察结果
[0352][0353]
实验结果表明供试品溶液在24小时内稳定
[0354]
6.中间精密度考察
[0355]
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批玫瑰花标准汤剂(bt201820)约0.1g，精密称定，平行6份，按实施例3.1中供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按实施例3.1中色谱条件测定，结果见下表。
[0356]
表29中间精密度考察结果
[0357][0358][0359]
实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，鞣花酸含量结果rsd《2％，该分析方法中间精密度良好。
[0360]
7.耐用性考察
[0361]
①
不同色谱柱考察
[0362]
比较了岛津、安捷伦、ymc 3种色谱柱(都为c18色谱柱)对玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定的影响。
[0363]
取玫瑰花标准汤剂(bt201821)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，按实施例3.1所述色谱条件，实验结果见图35、下表。
[0364]
表30不同色谱柱耐用性考察结果
[0365][0366]
实验结果表明该分析方法不同色谱柱耐用性很好。
[0367]
②
不同色谱仪考察
[0368]
根据实验室现有设备，选取waters色谱仪与塞默飞色谱仪，比较两种色谱仪对玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定的影响。
[0369]
取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，按实施例3.1所述色谱条件，实验结果如下表。
[0370]
表31不同色谱仪耐用性考察结果
[0371][0372]
实验结果表明该分析方法不同色谱仪耐用性较好。色谱仪的变动能满足系统适用性要求。
[0373]
③
不同柱温考察
[0374]
比较25℃、30℃、35℃不同柱温对玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定的影响。
[0375]
取玫瑰花标准汤剂(bt201820)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液，按实施例3.1中所述色谱条件，实验结果如图36和下表所示。
[0376]
表32不同柱温耐用性考察结果
[0377][0378]
实验结果表明该分析方法不同温度耐用性较好。温度小的变动能满足系统适应性要求。
[0379]
④
不同流速考察
[0380]
比较0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min不同流速对玫瑰花标准汤剂鞣花酸含量测定的影响。
[0381]
取玫瑰花标准汤剂(bt201821)，用实施例3.1中所述供试品溶液制备方法制备得到供试品溶液液，按实施例3.1所述色谱条件，实验结果图37、下表所示。
[0382]
表32不同流速耐用性考察结果
[0383][0384]
实验结果表明该分析方法不同流速耐用性较好。流速小的变动能满足系统适应性要求。
[0385]
⑤
范围实验
[0386]
由前述实验结果知，玫瑰花药材的鞣花酸含量的最小值批号为bt201820，最大值批号为bt201810，以这两个数值作为鞣花酸范围值，结合重复性和准确度进行实验。
[0387]
a含量最大值与最小值重复性实验
[0388]
分别取批号为bt201820、bt201810的玫瑰花药材约0.1g，精密称定，各平行称定6份，按实施例3.1确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。每份精密吸取5μl按实施例3.1中色谱条件测定，测定供试品溶液中鞣花酸含量，计算rsd，测定结果见下表。
[0389]
表33含量最大值重复性考察结果
[0390][0391]
表34含量最小值重复性考察结果
[0392][0393]
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
[0394]
b含量最大值与最小值加样回收率考察
[0395]
分别取已知含量的bt201820、bt201810玫瑰花标准汤剂0.05g，精密称定，各平行称定6份，每份加入相近量的鞣花酸对照品，按实施例3.1下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液。每份精密吸取5μl按实施例3.1下色谱条件测定，计算鞣花酸加样回收率，见下表。
[0396]
表35最大值鞣花酸加样回收率实验结果(n＝6)
[0397][0398]
表36最小值鞣花酸加样回收率实验结果(n＝6)
[0399][0400]
实验结果显示最大值与最小值鞣花酸回收率分别为99.68％、100.21％，根据《中国药典》2015版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量为10％时，回收率限度为95％～102％，表明回收率良好。