西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定SNP分子标记及其用途的制作方法

• 花匠小妙招
• 2025-11-05 15:35

本发明属于蔬菜抗病分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒分子标记开发及其应用，

背景技术：

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaicvirus,cgmmv)是一种正单链rna病毒，形状为直杆状，属烟草花叶病毒属(tobamovirus)，于1935年第一次在英国报道(ainsworth,1935)。主要侵染葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、瓠瓜等，还会侵染蔓陀罗、苋色藜、本生烟和普通烟等，不同株系的cgmmv在不同寄主植物上表现的症状不同，西瓜株系cgmmv可引起西瓜花叶、斑驳、叶片突起、植株矮化和果实倒瓤等症状。cgmmv的适应性和抗逆性极强，常温下可以存活数月，低温条件下可以存活数年，在土壤里能至少保持十个月的侵染力(varverietal.,2002)。其传播途径一般为种子传播、土壤传播、接触摩擦传播、人工嫁接、授粉、农事操作等，现也有报道称烟蚜可能传播黄瓜绿斑驳花叶病毒(洪璠璠等,2018)。目前cgmmv的防治主要方法有加强检验检疫工作、种子消毒处理、苗木嫁接、分子育种以及生物化学防治等(杨柳等,2018)。

为了探究cgmmv侵染西瓜早期的发病机理，有学者对cgmmv侵染24h后的西瓜叶片和受到cgmmv侵染的西瓜果实进行了转录组分析，以未接种病毒的健康植株作为对照，通过geneontology(go)分析、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(kegg)通路富集分析得到了许多有表达差异的基因，主要将这些有表达差异的基因归类于光合作用、植物-病原体互作、次生代谢物、植物激素信号转导、cgmmv侵染后应激反应，为研究cgmmv发病机理提供了新思路(lietal.,2017；sunetal.,2019)。

西瓜野生品种‘p.i.595203’被证实对小西葫芦黄花叶病毒(zucchiniyellowmosaicvirus,zymv)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(papayaringspotviruswatermelonstrain,prsv-w)和西瓜花叶病毒(watermelonmosaicvirus,wmv)均具有抗性，其中‘p.i.595203’对zymv-ch的抗性由隐性单基因zym-ch控制，对wmv的抗性至少由3个以上的隐性基因控制，这2种病毒的抗病基因相对独立p.i.595203对prsv-w的抗性也是由隐性单基因prs-w控制(xuetal.,2004)。本实验室前期研究表明p.i.595203对cgmmv表现为抗性，其抗性性状由一个以上隐性基因控制的(刘洁，2019)，但没有确定到具体的抗病基因。由于国内外对抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的种质鉴定、抗性遗传规律、抗性基因连锁分子标记等方面的研究尚少，影响西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病的高通量筛选鉴定。

上文中涉及的参考文献如下：

li,x.,an,m.,xia,z.,bai,x.,&wu,y.transcriptomeanalysisofwatermelon(citrulluslanatus)fruitsinresponsetocucumbergreenmottlemosaicvirus(cgmmv)infection.scientificreports,2017,7(1).

sun,y.,fan,m.,&he,y.transcriptomeanalysisofwatermelonleavesrevealscandidategenesresponsivetocucumbergreenmottlemosaicvirusinfection.internationaljournalofmolecularsciences,2019,20(3):610.

xu,y.,kang,d.,shi,z.,shen,h.,&wehner,t.inheritanceofresistancetozucchiniyellowmosaicvirusandwatermelonmosaicvirusinwatermelon.journalofheredity,2004,95(6):498-502.

刘洁.西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病遗传分析与抗性基因定位研究，2019.

洪璠璠,刘大成,杨柳,杨中侠.烟蚜传播黄瓜绿斑驳花叶病毒的可能性及方式.中国农学通报,2018,34(26):134-139.

杨柳,任春梅,缪倩,陆芳,程兆榜.黄瓜绿斑驳花叶病毒的双抗夹心elisa检测.江苏农业学报,2018,34(4):769-774.

ainsworth,g.c.mosaicdiseasesofthecucumber.annalsofappliedbiology,1935,22(1):55-67.

varveri,c.,vassilakos,n.,&bem,f.characterizationanddetectionofcucumbergreenmottlemosaicvirusingreece.phytoparasitica,2002,30(5):493-501.

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是找到与西瓜中黄瓜绿斑驳病毒抗性连锁的单核苷酸多态性标记，提供一种基于bsa混池定位抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病基因开发的用于西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定的分子标记及其开发方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于bsa混池定位抗病基因定位开发的用于西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定的分子标记，以下西瓜为物种，所述分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，

cgmmvr：等位引物1：gaaggtgaccaagttcatgctgtccgaaaaggcgtacca

等位引物2：gaaggtcggagtcaacggattgtccgaaaaggcgtaccg

通用引物：aatgagaagggcaagcattc

说明：

cgmmvr针对的是等位引物1和2中3’末端位置的a/g位点，见下表1。

表1

本发明还同时提供了上述分子标记的用途，用于鉴定西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性种质或其后代的辅助选择育种。

具体为：

当筛选西瓜野生种质‘p.i.595203’和栽培种‘m1511-3’的杂交和回交后代时，选择后代中基因型与抗病西瓜基因型‘p.i.595203’一致或者同时具有‘p.i.595203’和‘m1511-3’基因型时的单株用于育种；

当在若干(例如数百份)西瓜种质中筛选抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病种质时，选择种质中基因型与抗病西瓜‘p.i.595203’基因型一致或者同时具有‘p.i.595203’和‘m1511-3’基因型的种质用于育种。

本发明提供了西瓜中黄瓜绿斑驳病毒抗性连锁的单核苷酸多态性鉴定方法，包括以下步骤：

1)、以抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜‘p.i.595203’与感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜‘m1511-3’为亲本进行杂交，然后自交，从而获得作为f2代的抗/感病分离的单株；

2)、用植物基因组dna快速提取法提取西瓜亲本幼苗及f1、f2代幼苗基因组dna；

3)、采用bsa方法定位与抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病相关的区域或基因；

4)、鉴定到与西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病连锁的单核苷酸多态性序列。

本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：

1)、以抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜野生种质‘p.i.595203’与感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜栽培种‘m1511-3’杂交，然后自交，获得作为f2代群体；以f1为母本与‘p.i.595203’回交获得bc1群体，对与西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病连锁的单核苷酸多态性序列的遗传分离进行验证；

2)、抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜野生种质‘p.i.595203’与感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜栽培种‘m1511-3’杂交和回交，从而获得作为后代的抗病西瓜单株；

3)、用植物基因组dna快速提取法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组dna；

4)、采用kasp(竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，kompetitiveallelespecificpolymerasechainreaction)方法进行西瓜中抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病标记的开发；

5)、开发出一个基于单核苷酸多态性的西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病分子标记。

与西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病有关的分子标记cgmmvr，具体采用下述方法获得：

1)、比较抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜野生种质‘p.i.595203’和感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜栽培种‘m1511-3’与抗性连锁区域的基因组序列，鉴定到抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜野生种质‘p.i.595203’和感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜栽培种‘m1511-3’与抗性连锁基因组区域存在snp变异，即，通过测序检测出两亲本中抗性连锁基因组区域内部在分子标记限定的片段上存在差异；

2)、基于抗/感黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜中与抗性连锁基因组区域的snp变异，设计引物；

3)、用植物基因组dna快速提取法提取西瓜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组dna

4)、采用kasp方法进行西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病标记的筛选；

5)、开发出kasp标记cgmmvr，经相关性检测，发现其与西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性连锁，采用该标记可以用来鉴定西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病的抗性种质。

采用上述分子标记进行西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性筛选的方法具体是：

(1)分子标记在‘p.i.595203’和‘m1511-3’中抗/感黄瓜绿斑驳花叶病毒病多态性分析：

设计开发分子标记，每个分子标记由等位引物1、等位引物2、通用引物组成；用于检测p.i.595203’和‘m1511-3’中抗/感黄瓜绿斑驳花叶病毒病的多态性。备注说明：引物(分子标记)可委托上海桑尼生物科技有限公司合成，在abisetponepcr仪上进行扩增。

pcr反应体系为：20-50ng/μl西瓜基因组dna5.0μl，kaspmastermix5.0μl，kaspassaymix(10ng/μlfam引物1、10ng/μlhex引物2、10ug/μl通用引物，三种引物的体积比为12:12:30)0.14μl，总体积为10.14μl。

反应程序：

30℃，1分钟(读取荧光信号)；

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸；以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)，55℃60秒，扩增26个循环；

30℃，1分钟(读取荧光信号)；

扩增结束后，检测荧光信号并查看基因分型情况。

(2)分子标记cgmmvr在不同抗性的‘p.i.595203’和m1511-3间的snp差异：

根据获得的分子标记cgmmvr，用于检测不同黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性的‘p.i.595203’和m1511-3间的snp，根据荧光信号的不同，判断snp的基因型。

(3)利用cgmmvr分子标记开展西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病辅助选择育种：

抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜‘p.i.595203’与感病西瓜‘m1511-3’进行杂交，然后自交，获得f2后代群体，将‘p.i.595203’的抗病基因导入到‘m1511-3’中，选择分离群体中基因型与‘p.i.595203’基因型一致的单株用于育种改良，获得了若干份‘m1511-3’背景的含有‘p.i.595203’抗病基因的材料，通过接种黄瓜绿斑驳花叶病毒，发现其抗病性显著增加。

在184份西瓜种质资源中，筛选出7份材料与‘p.i.595203’基因型相同，对其进行黄瓜绿斑驳花叶病毒的接种，发现这些材料对黄瓜绿斑驳花叶病毒均具有不同程度的抗性。

抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病是提高西瓜产量的重要前提。本发明采用分子遗传学方法以含有抗病基因的‘p.i.595203’为材料，开发了黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性的分子标记及其方法，用于西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病辅助选择育种。由于研究所用的材料抗病基因能提高西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病能力，其对我国西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病分子设计育种具有普遍性。

本发明创造了西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病基因连锁的的kasp标记cgmmvr。采用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需要周期长、抗病鉴定稳定性差等缺点，可以有目标地将‘p.i.595203’的抗病基因在实验室内选择获得，并有目的地进行多个抗病基因的聚合，而从培育出具有抗多种病害的西瓜新品种。在本发明中，当后代植株中检测到具有‘p.i.595203’基因型时，判定其属于抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病西瓜，当后代植株中检测到具有‘m1511-3’的基因型或者同时出现‘p.i.595203’和‘m1511-3’基因型时，我们判定其属于感病西瓜。

本发明可适用于大部分的西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病的标记选择。

因此，本发明结果在西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病育种实践中具有重要意义；其优点具体归纳如下：

(1)本发明的能实现西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病分子标记，是通过含有抗病基因的‘p.i.595203’西瓜与感病“m1511-3”西瓜遗传分离群体获得，并在杂交、回交和自交中筛选中应用，能显著提高黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性，而且稳定遗传，可用于西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性的辅助选择育种。

(2)本发明依据的是与西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病基因紧密连锁的的核苷酸序列开发而来的kasp标记，极大提高了辅助选的效率和效果。

本发明为西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病的高通量筛选鉴定和回交育种提供一种新型分子标记及辅助选择方法。

本发明所获得的分子标记为西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性标记，能用于西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性的辅助选择育种。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是抗病西瓜‘p.i.595203’、感病西瓜‘m1511-3’、‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染后感病症状；

图2是基于bsa的抗病基因在染色体上的定位。

图3是kasp标记cgmmvr在‘p.i.595203’、‘m1511-3’和f1中的基因型图，其中‘p.i.595203’抗病基因型为aa、‘m1511-3’感病基因型为gg、f1基因型为ag。

图4是kasp标记cgmmvr在‘p.i.595203’、‘m1511-3’和f2中发生分离，说明该标记可用于后代抗性植株的筛选。

图5是kasp标记cgmmvr在184份西瓜种质资源以及f1的基因型图，其中抗病基因型为aa、感病基因型为gg、杂合基因型为ag，nocall表示样品没有荧光信号。

图6随机挑选基因型为aa、ag和gg的西瓜品种侵染瓜绿斑驳花叶病毒侵染后抗病和感病表型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、西瓜野生种质‘p.i.595203’和栽培种‘m1511-3’黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定：

从实验室种质资源库中选取西瓜材料---‘p.i.595203’、‘m1511-3’、‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1后代，黄瓜绿斑驳病毒接种，采用植株表型症状判定抗性；如图1。

具体如下：

一、黄瓜绿斑驳花叶病毒接种：

在西瓜苗一叶一心叶期进行接种，称取已感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的新鲜病叶2g，放入高温灭菌的研钵中，按照1:10(w/v，即，1g:10ml)的比例加入相应体积的0.02mol/lpbs缓冲液(ph7.2)研磨成浆，作为病毒汁液，用于人工摩擦接种。接种时，首先在待接种的西瓜子叶正面均匀撒上少许绿色碳化硅，吸取约20μl病毒汁液滴于每株待接种的两片子叶上，然后用戴有手套的干净食指在叶面上反复摩擦2-4次进行病毒接种(子叶上出现小面积浅伤口即可，不可摩擦过重，可能造成植株死亡)，设置的对照假侵染(mock)使用pbs缓冲液代替病毒汁液进行摩擦接种。接种病毒15分钟后用清水冲洗叶面上残余的病毒汁液和绿色碳化硅，然后置于黑暗下继续培养24-36小时后转移至光照温室内生长，可视情况在一周后对新叶进行重复侵染以确保植株感染上病毒，正常培养3周后可进行病毒的抗性鉴定。

二、植株发病症状观察

接种3周后，根据西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病等级划分标准来对西瓜植株的抗病等级进行调查统计。

植株发病情况如下：

0级：叶片形状、颜色表现正常，无任何感病性状。

1级：嫩叶正常，大部分叶片表现正常，部分有少量褪绿斑。

2级：嫩叶微卷曲，叶片黄化，伴有轻度花叶。

3级：嫩叶卷曲伴有黄色花叶，全株花叶、叶片皱缩不平、生长迟缓矮化。

4级：嫩叶卷曲伴有黄色花叶，全株重花叶、皱缩不平，部分叶片畸形，部分叶片坏死，生长迟缓矮化。

病级0级和1级为抗病，2-4级为感病。

根据图1，黄瓜绿斑驳花叶病毒接种3周后，‘p.i.595203’几乎不发病或叶片上只有零星点的病斑，表现出对黄瓜绿斑驳花叶病毒病具有很强的抗性，‘m1511-3’植株叶片出现斑驳、花叶、绿色隆起甚至死亡，表现出对黄瓜绿斑驳花叶病毒病高度敏感；同时在‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1代中，f1植株出现严重的斑驳花叶、隆起以及叶片畸形等病状，表现出对黄瓜绿斑驳花叶病毒病高度敏感，该西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病表现为隐性遗传。

实施例2、黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性遗传分析与基因定位：

从实验室种质资源库中选取甜瓜材料---‘p.i.595203’、‘m1511-3’、‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1后代以及f1自交获得的f2群体，黄瓜绿斑驳花叶病毒接种，采用植株表型症状判定抗性，进行抗病性遗传分析。然后基于bsa方法进行抗病基因定位，如图2。

抗性遗传分析：采用实施例1中黄瓜绿斑驳花叶病毒接种方法对f2群体的304个单株进行接种，根据表型判定抗性情况，f2群体对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的抗病性会发生分离，其中抗病植物33株，感病植株271株，表明该西瓜的抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病性状是由隐性多基因控制。

抗性基因定位：

一、提取dna

1)、dna提取

dna提取试剂盒选择杭州莱枫生物科技有限公司生产的植物总dna提取试剂盒(plantdnazol)。

①、称取0.1g上述西瓜叶片用液氮研磨成粉状，然后参照dna提取试剂盒提供的操作步骤提取总dna。

②、采用nanodrop2000超微量分光光度计检测上述所得的dna样品浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。

二、抗性基因定位

由2个感抗亲本、1个f1及2个f2抗感病子代混池样本构建感抗池，进行基因组重测序，通过snp-index方法进行关联分析，选取99％作为筛选的关联阂值，定位到1个位于4号染色体的关联区域，位于染色体上20.95-21.96mb区间。在西瓜数据库(http://cucurbitgenomics.org/)中4号染色体上关联的候选区域20952112-21955761一共包含56个候选基因。通过非同义突变的snp位点分析以及基因注释分析，筛选出感兴趣的9个基因，下一步进行基因验证。

这9个基因根据基因组注释分别是clcg04g006450，clcg04g006480，clcg04g006580，clcg04g006590，clcg04g006690，clcg04g006700，clcg04g006770，clcg04g006840，clcg04g006870，本发明的分子标记对应的基因是clcg04g006480。

实施例3、用kasp标记cgmmvr的开发与验证

从实验室种质资源库中选取西瓜材料---‘p.i.595203’、‘m1511-3’、‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1后代、f1自交获得的f2群体以及其他184份西瓜种质，首先将snp转化为kasp标记，利用引物kasp标记cgmmvr扩增鉴定其基因型和遗传分离规律。

具体如下：

1、kasp标记cgmmvr的开发：

一、snp信息提取：

根据实施例2中基因定位结果，提取与抗病基因紧密连锁的snp信息。

二、提取dna

提取‘p.i.595203’、‘m1511-3’、‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1后代基因组dna，方法同实施例2。

三、pcr扩增

1)、反应体系

引物序列如下：

等位引物1：gaaggtgaccaagttcatgctgtccgaaaaggcgtacca

等位引物2：gaaggtcggagtcaacggattgtccgaaaaggcgtaccg

通用引物：aatgagaagggcaagcattc

pcr反应体系为：20-50ng/μl西瓜基因组dna5.0μl，kaspmastermix5.0μl，kaspassaymix(10ng/μlfam引物1、10ng/μlhex引物2、10ug/μl通用引物，三种引物的体积比为12:12:30)0.14μl，总体积为10.14μl。

2)、反应程序

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸；以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)，55℃60秒，继续扩增26个循环。

扩增结束后，检测荧光信号并查看基因分型情况。

直接在abistepone荧光定量pcr仪上进行pcr反应，所述pcr仪连接abistepone软件，从而直接获得分析结果，即，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合抗病型，纯合感病型和杂合抗病型。

等位引物1、等位引物2前分别设置各自的荧光接头(为不同颜色，例如gg型为红色，aa型为蓝色，ag型为绿色)，如果检测的材料是纯合型时，扩增的时候只会选其中对应的一个引物扩增(例如，‘p.i.595203’只能与等位引物1发生反应)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是纯合抗病型还是纯合感病型，如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会被用到，产生的荧光不同于纯合型的材料，从而实现区分杂合型。

根据图3，可得知：利用cgmmvr引物对分别从‘p.i.595203’和‘m1511-3’基因组中检测到基因型为aa和gg，在‘p.i.595203’和‘m1511-3’杂交f1后代中检测到基因型为ag。由此表明，kasp分子标记cgmmvr能用于‘p.i.595203’和‘m1511-3’之间及其后代的基因型鉴定。

2、kasp标记cgmmvr的验证：

一、提取dna

提取实验室184份高度自交系西瓜种质基因组dna，方法同实施例2。

二、pcr扩增

同上。

根据图5，可得知：为验证该标记的正确性，利用cgmmvr引物对本实验室保存的184份西瓜种质进行检测，检测到aa、gg两种基因型，其中177份材料为gg基因型，7份材料为aa基因型，对7份与‘p.i.595203’基因型相同的材料进行黄瓜绿斑驳花叶病毒的接种，实验结果表明基因型为aa的7份种质材料对黄瓜绿斑驳花叶病毒病均具有不同程度的抗性。随机从gg基因型中选取3份材料进行接种验证，实验结果表明基因型为gg的3份材料均为感病。由此验证kasp分子标记cgmmvr与黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性紧密连锁。

因此，可证明分子标记cgmmvr的正确性。

实施例4、用kasp标记cgmmvr开展西瓜抗黄瓜绿斑驳花叶病毒病辅助选择育种

对‘m1511-3’和‘p.i.595203’杂交，然后采用f1自交，获得f2后代分离群体，采用kasp标记cgmmvr进行标记辅助选择，如图4所示，f2后代中选择基因型与和‘p.i.595203’一致或者同时出现‘m1511-3’和‘p.i.595203’基因型时的单株进一步用于育种改良。

具体如下：

一、提取dna

同实施例2。

二、pcr扩增

同实施例3。

三、基因型检测

同实施例3。

最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变性。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒病抗性鉴定snp分子标记及其用途

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctgtccgaaaaggcgtacca39

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgtccgaaaaggcgtaccg39

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatgagaagggcaagcattc20

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