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生物技术通报 | 旱柳SmERF B3-45的克隆及耐盐功能研究

花匠小妙招
2025-11-07 01:40

华炫，田博雯，周欣彤，江梓涵，王诗琦，黄倩慧，张健，陈艳红

植物在生长过程中会受到各种非生物胁迫的影响，在其生长和发育的多个方面产生负面效应。其中， 盐胁迫作为一种主要非生物胁迫，会引起植物产生渗透胁迫和离子胁迫，从而导致植物生长发育受到限制。为了解决日益增长的人口带来的粮食需求和土地盐碱化导致耕地面积减少等问题，挖掘出可以调控植物耐盐性的基因用来保障耕地面积和加强粮食安全成为一大研究热点。

乙烯响应因子（ERF）是植物特有的一类转录因子，属于AP2/ERF超家族的一个亚家族，AP2/ERF 超家族由AP2结构域定义，该结构域由60-70个氨基酸组成。该超家族还包含AP2、RAV、DREB和Soloist等亚家族，这些亚家族成员中，DREB含有一个AP2结构域，AP2含有2个AP2结构域，RAV含有一个AP2和一个B3结构域，Soloist亚家族通常只有1-2个成员，具有不太保守的AP2结构域。AP2结构域可通过和DNA序列上CG-Box等特定位点结合，激活植物的抗性相关基因的表达。 研究表明，ERF在植物生长、代谢和逆境的胁迫反应中发挥着至关重要的作用。目前，已从大豆、玉米、小麦等多种植物中分离、克隆出ERF基因并进行了功能分析，结合转基因技术获得过表达或表达沉默的转基因植株，进行表型和生理指标测定等多项分析，结果表明，其显著提高了植物的抗逆性。ERF在调节耐盐性方面也扮演着重要角色。 AP2/ERF基因家族的ERF转录因子成员作为耐盐基因资源的重要来源，相关研究日益增加。

旱柳（Salix matsudana Koidz）在生态环境改善如盐碱地改良、城乡绿化面积增长和水土流失减少等方面具有巨大的应用潜力。鉴于AP2/ERF转录因子超家族在植物响应非生物胁迫尤其是盐胁迫中的重要作用，前期的研究表明，四倍体旱柳中AP2/ERF转录因子家族成员数量共有364个，AP2、ERF、DREB、RAV和Sololist亚家族成员数量分别为55、166、135、6和2个。尽管AP2/ERF超家族转录因子在逆境胁迫响应中的作用已被广泛研究且取得了较大进展，特别是在模式植物如拟南芥和水稻中。然而， 对于木本植物，尤其是柳树（Salix）中的AP2/ERF超家族成员的功能研究相对较少。

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本文主要包括以下几部分内容：

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1SmERF B3-45启动子区顺式作用元件分析

2.2 SmERF B3-45基因的克隆和过表达、VIGS和亚细胞定位载体构建

2.3 SmERF B3-45及其同源蛋白的生物信息学分析

2.4SmERF B3-45表达模式分析

2.5 过表达SmERF B3-45增强拟南芥植株的耐盐性

2.6 SmERF B3-45沉默降低柳树耐盐性的研究

3 讨论

4 结论

向下

研究证明，土壤盐渍化会对植物的生长和发育产生负面影响。因此， 发掘耐盐基因用来培育耐盐转基因植物品种是应对土壤盐渍化、保障粮食安全和保护生态环境的重要举措。目前，已经对各种植物进行了耐盐机制的研究，除拟南芥、水稻等模式植物外，还包括油料作物花生、灌木白刺、蔬菜番茄、树木杨树和各种观赏开花作物等。这些研究鉴定了植物调控耐盐性的一般机制。

大量研究表明， AP2/ERF基因家族是转录因子中具有多种功能的最大超家族之一，特别是在调节植物耐盐和耐旱等抗性方面发挥重要。如今，在拟南芥和农作物特别是玉米和水稻中已经广泛展开了对AP2/ERF基因家族成员调控植物耐盐性的作用和机制的研究。但是相较这些植物而言， 林木中对AP2/ERF基因家族调控植物的耐盐性的研究还比较少。

随着基因组测序技术飞速发展，旱柳的全基因组序列信息已经获得，也开展了AP2/ERF基因家族成员的相关研究，都为从旱柳中挖掘更多耐盐基因提供了便利。 本研究发现SmERF B3-45是一个可以正向调控植物耐盐性的基因。在这项研究中，先是对SmERF B3-45的启动子区顺式作用元件进行分析发现，SmERF B3-45含有多种顺式作用元件，包括参与ABA响应的ABRE元件，参与赤霉素响应的TATC-box元件和参与干旱、盐和低温响应的MYB元件。推测SmERF B3-45可能参与逆境胁迫响应表达调控途径。之后成功克隆出SmERF B3-45，发现其主要在根中进行表达，并且NaCl处理后其表达量明显上升。进化树表明，SmERF B3-45和白柳中的Sabra14G0034100存在较近的亲缘关系，序列分析表明这些蛋白质共享一个保守的AP2/ERF结构域。进化树中罗列的3个拟南芥相关直系同源基因的功能均有报道。SmERF B3-45存在比较普遍的表达模式，并且主要定位于细胞核中，盐胁迫响应的表达模式表明其可能具有调控盐胁迫响应的作用。本研究中，过表达SmERF B3-45转基因拟南芥植株产生了更高的表达量和较强的耐盐胁迫的表型。再者，病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）一直以来都是研究基因功能的有效方法。本研究在VIGS试验中降低了旱柳植株中SmERF B3-45的表达水平。与对照植株相比，VIGS旱柳植株观察到更多的落叶和萎蔫的枝叶。

在转基因拟南芥中，总蛋白含量、Na+含量、MDA含量和Na+/K+较野生型显著降低，CAT含量和K+含量较野生型显著升高。并且基因沉默柳树植株的根中的总蛋白含量显著低于pTRV2 植物，而MDA和脯氨酸含量都显著高于阴性对照植株。以上 在拟南芥中的异源遗传转化试验和柳树中的瞬时遗传转化试验均表明SmERF B3-45可以正向调控拟南芥的耐盐性。

本研究通过过表达和沉默表达一正一反两项试验共同验证了SmERF B3-45正向调控耐盐性的功能，并通过生理指标测定、亚细胞定位和进化树等进行了进一步研究。与其他研究相比，本研究较为全面地论证了其正向调控耐盐性的功能。但是其具体机制尚不清楚，和上文所讨论的调控通路间的相互作用关系还需要进一步地研究进行揭示。

SmERF B3-45属于旱柳AP2/ERF转录因子家族，定位于细胞核。盐处理后其表达量提高，SmERFB 3-45为盐胁迫调控网络中的正调控因子，通过调节Na+、K+离子含量、减弱氧化胁迫损伤等机制增强植物对盐胁迫的抵抗力。

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《生物技术通报》是由中国农业科学院农业信息研究所主办、生物工程技术领域高水平综合性学术期刊，由知名科学家谢旗研究员担任期刊主编。主要报道与农业科学相关的国内外生物技术领域最新基础研究成果，致力于为学术共同体打造学术成果传播和交流的优秀平台。目前是中文核心期刊、中国科技核心期刊，入选CSCD核心库、RCCSE核心，“百种中国杰出学术期刊” “中国精品科技期刊” “中国科技期刊卓越计划”入选期刊。