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植物线虫病害如何诊断？

花匠小妙招
2024-10-11 00:13

植物线虫害为什么难防难治？由于线虫形体小、活动性强，线虫病害很难诊断。及早的发现植物病原线虫，尤其是在植株还没有症状的情况下尽早诊断，才能及时防止病原线虫的侵害和传播，最大程度降低损失。

线虫并非只有发病土壤中才有，健康的土壤中也有线虫存在。在自然界的各种土壤中都存在非常多的线虫，可以说“哪里有植物，哪里就有线虫”；因此，无论采集健康土壤，还是发病土壤，均能分离到线虫。

并不是所有的线虫都是有害的。有很多线虫反而对土壤和作物有益，例如腐生线虫可以加速营养物质转化；而一些捕食性线虫，则能够以细菌、真菌甚至其他线虫为食，是有益的物种。在农业生产中，植物寄生线虫才是最大的危害者。因此，我们并不能够从土壤中是否有线虫的存在，来判定土壤的健康状况，以及是否有利于种植作物。

怎样科学地诊断线虫病害？ 一看地上，二看地下，三从镜中找病原。

一看地上：线虫侵入植株后，地上部分主要表现为植株生长缓慢，植株矮小，有暂时性萎蔫的情况。但是随着线虫损害根系的程度加重，植株出现嫩枝干枯，变脆易折的现象；叶片逐渐发黄，变小变薄，生长势十分衰弱，有时症状类似缺素症或者缺水、缺肥的状态。当根部危害进一步严重时，叶片会全部褪绿黄化，边缘卷曲，大量落叶，开花数量增加，结实少。最后，植株全部萎蔫枯死。

二看地下：大部分线虫主要为害植物根部，在根部有明显的症状。以根结线虫为例，根结线虫侵入寄主植物根部后，根部初期首先膨大，形成肿瘤状根结；随着线虫繁殖数量的增加，有些植物根结连接成块；有些植物受害的侧根和须根则成为念珠状的结构；有些在根结上仍然可以萌发小须根，但是很快会被线虫侵染，形成大小不等的根结，并且先后形成的根结交织在一起，形成须根团结构。

根结形成初期是乳白色，后期变为黄褐色，直至腐烂成为黑褐色。此时，受害植物一般都停止生长，主根皮层部位腐烂，甚至整个根系全部腐烂，有时候会散发恶臭味道。孢囊线虫危害后，根部虽然不肿大，但在小麦抽穗期或大豆开花期，可以在根部观察到白色的圆形雌虫。

三看镜中病原：线虫有特殊的分离方法，如孢囊线虫可用漂浮法从土壤中分离孢囊，或者用浅盘法分离幼虫。具体操作方法是：在托盘上放置一个200目的筛子，筛子上放上一层纸巾，取200 ml土壤放在上面，托盘上倒入适当的水刚没过土壤即可，第二天就可通过收集托盘内的水来获取土壤内的线虫了。

线虫分离后，挑取单条线虫用60度左右的温水杀死后，置于显微镜下观察虫体形态、口针、尾部、体壁等形态学特征，如孢囊形态和阴门锥是鉴定孢囊线虫的重要依据，雌虫的会阴花纹是鉴定根结线虫的重要依据。

然而，由于形态学鉴定需要经验丰富的农技人员才能完成，并且费时费力。另外，有许多不同种类的线虫在形态上非常相似，难以区分。因此，在实际生产中，依靠形态诊断病原线虫往往很难开展。能实现快速准确的诊断吗？

可以通过分子生物学的技术进行快速、准确的诊断。

7种病原线虫分子诊断方法：

1. 聚合酶链式反应鉴定法

DNA水平上的分子鉴定由于不依赖基因的表达产物，且不受线虫发育的影响而成为稳定的鉴定手段。提取单条植物病原线虫的DNA后，利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction , PCR）可在相对短的时间扩增出大量特定的DNA片段，将扩增的DNA片段测序后与已知的序列比对就能鉴定出线虫的种类。在目前的植物病原线虫的PCR分子鉴定中，利用最多的是基因组的核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS），已开发出多种通用引物和特异性引物能将植物病原线虫快速鉴定出来。

2.限制性片段长度多态性分析鉴定法

限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是将PCR扩增后的DNA片段用限制性内切酶消化，再经琼脂糖凝胶电泳分离得到电泳图谱，如果不同的植物病原线虫位于酶限制位点内的序列存在一定差异，那么PCR产物消化后将得到特异的电泳图谱。将新获得的样品与已知物种的RFLP电泳图谱进行比对就可快速鉴定出植物病原线虫的种类。该技术特别适用于鉴定单种类的植物病原线虫，而不能鉴定混合的植物病原线虫种群。

3. 反向斑点杂交鉴定法

反向斑点杂交鉴定（Reverse Dot-blot Hybridization）是指利用PCR扩增得到大量的含有标记的DNA片段，再将其与膜上的特异性固定化的寡核苷酸探针杂交的鉴定方法。如有杂交信号产生，则为对应的植物病原线虫。该方法可用于同时鉴定单个样品中的混合的植物病原线虫种群。

4. 随机扩增多态性DNA标记鉴定法

随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD）是指利用随机多态核苷酸序列引物，以植物病原线虫基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离得到具有多态性的电泳图谱，扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。将新获得的样品与已知物种的RAPD电泳图谱进行比对就可快速鉴定出植物病原线虫的种类。

5. 实时荧光定量PCR鉴定法

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）是利用特异性引物、荧光探针和荧光DNA结合染料来监测靶DNA分子的PCR扩增，实时荧光定量PCR能够量化样品中的DNA量。因此可利用该技术通过假设样本中的目标DNA拷贝数与目标植物病原线虫的数量成比例来间接测量线虫数量。

6. 环介导等温扩增鉴定法

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）是指利用一组基于靶DNA的六个或八个不同区域的4-6个设计的特异性引物和链置换DNA聚合酶，在60-65°的等温温度下对DNA模板进行扩增。通过添加核酸嵌入染料、溴化乙锭或测量焦磷酸镁形成的浊度来检测扩增产物的量。由于此方法具有耗时短、操作简单、不需要特殊设备等优点，因此在基层植物病原线虫的检测中有可能得到广泛的应用。

7. DNA条形码技术鉴定

DNA条形码技术（DNA barcoding）的思想源自商品条形码识别技术，其愿景是用植物病原线虫共同基因的特定核苷酸序列来作为每个植物病原线虫种的独特标识符。关于DNA条形码应用的分类学家之间存在相当大的争论，目前提出了几种标记物（18S rRNA，28S rRNA的D2-D3，ITS rRNA，COI和其他基因）用于植物病原线虫的DNA条形码，但都存在或多或少的问题。此方法要求有准确的植物病原线虫的DNA条形码参考数据库，因此还在不断地完善之中。

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