免疫组化双染实验流程
免疫组化双染实验流程
互联网2008-06-21
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一、脱蜡和水化
方法同SP法。
二、第一抗体的染色
1、将切片浸在3%H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中10min，PBS冲洗3min×3次；
2、加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10min，倒掉（不能冲洗）；
3、加入一抗（按照说明书推荐浓度和孵育条件）；
4、使用含有0.05%吐温20的PBS（TPBS），冲洗5min×3次；
5、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10min；
6、用TPBS冲洗5min×3次；
7、加入100ul（2滴）链霉亲和素-AP（试剂3）的二抗，室温孵育10min；
8、用TPBS冲洗5min×3次；
9、准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀；
10、加100ul（2滴）配好的AP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；
11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。
三、第二抗体的染色
12、加100ul（2滴）双染增强剂（试剂7），孵育；
13、用TPBS冲洗3min×3次；
14、加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10min，倒掉（不能冲洗）；
15、加入稀释好的一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）；
16、用TPBS冲洗5min×3次；
17、加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10min；
18、用TPBS冲洗5 min×3次；
19、加入100ul（2滴）链霉亲和素-HRP（试剂5）的二抗，室温孵育10min；
20、用TPBS冲洗5min×3次；
21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀；
22、 加100ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；
23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应；
24、 使用复染试剂染色（根据需要选择）；
25、 封片剂（试剂8）封片，显微镜观察并拍照。
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