灵芝子实体、菌丝体及孢子粉中多糖成分差异比较研究
灵芝Ganoderma lingzhi Sheng H. Wu, Y. Cao & Y.C. Dai是担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属真菌（Cao et al. 2012;戴玉成等2013）,在我国已有数千年应用历史,早在《神农本草经》就记载灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效（游丽君等 2013）。现代研究发现灵芝具有广泛的药理作用,如抗肿瘤、免疫调节、镇静安神、抗心肌缺血、调节血脂等（林志彬 2001）,灵芝的多方面功效使之成为药用菌中研究最多和产品开发最多的药用真菌之一（张劲松等 2004）。
药典中规定灵芝为赤芝或紫芝的干燥子实体,因此子实体是中药和保健品中应用的主要药用部位。90年代发现灵芝的孢子粉具有较好药理活性,随着孢子粉产量的大幅度提高,灵芝孢子粉在保健产品中的应用已超过子实体。同时灵芝发酵菌丝体具有质量稳定、产量高等优点,在产品开发应用也越来越多。研究发现灵芝子实体、孢子粉及菌丝体3种材料均具有抗肿瘤、免疫调节等相似功效,其中活性成分报道最多的是多糖,在增强免疫力、抗氧化（Heleno et al. 2012）、抗肿瘤（Zhao et al. 2010）、降血糖等方面具有重要作用（张晓云和杨春清 2006;刘高强和王晓玲 2006;李建军等 2007）。灵芝药效与灵芝多糖活性和含量密切相关,灵芝多糖成为衡量灵芝产品质量优劣的最重要指标之一（谢意珍等 2002）。灵芝子实体、菌丝体或孢子粉这3种材料的化学基础是否一致,有无不同之处,目前尚无详细研究。我们对灵芝菌株G0109分别进行液体发酵、栽培及孢子粉收集,获得来自同一菌株的菌丝体、子实体和孢子粉,探讨这3种材料中多糖成分化学基础的差异,为将来产品开发的原料选择提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
G0109菌株来源于上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心,灵芝子实体和孢子粉材料为G0109菌株在浙江龙泉灵芝基地栽培采收获得,菌丝体由上海市农业科学院食用菌研究所发酵G0109菌株获得。
RAW264.7细胞株来源于中国科学院上海细胞库,并由上海市农业科学院食用菌研究所培养传代。
试剂：3,5-二硝基水杨酸、氯化钠、浓硫酸、葡萄糖、亚硫酸钠、氢氧化钠、硫酸铵、酒石酸钾钠、乙醇、硝酸钠、磷酸二氢钠均为国产分析纯试剂;苯酚国产分析纯试剂重蒸馏后使用;11种单糖标准品：D-Gal、D-Glc、D-Ara、L-Fuc、L-Rha、D-Man、D-Xyl、D-Fru、Rib、D-GluA和D-GalA均为Fluka产品;去离子水;DMEM高糖培养基、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、胰酶购自Gibco公司;青霉素、链霉素购自Amersco公司;细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、萘乙烯二胺盐酸盐、α-Amylase购自Sigma公司;endo-1,3-β-glucanase购自爱尔兰Megazyme公司;PBS配制：含0.14mol/L NaCl,0.004mol/L Na2HPO4,0.0027mol/L KCl,0.002mol/L KH2PO4,调pH至7.4,用蒸馏水定容至1L,备用。双抗：取等体积的l00μg/mL链霉素和30μg/mL青霉素混合均匀,备用。Griess试剂：吸取6.25mL H4PO3,补蒸馏水至250mL,然后加入0.25g萘乙烯二胺盐酸盐和2.5g磺胺,用磁力搅拌器搅拌直至全部溶解,4℃冰箱棕色试剂瓶保存。
1.2 方法
1.2.1 多糖含量测定：称取灵芝子实体、菌丝体或孢子粉样品100.0mg,加入85%乙醇20mL,超声,离心,去除上清后,沉淀加乙醇提取一次,沉淀挥去乙醇后,加入10mL蒸馏水,沸水浴加热2h,离心,上清液稀释（子实体、菌丝体及孢子粉稀释倍数分别为2倍、25倍、5倍）后用苯酚-硫酸法测定多糖。
1.2.2 多糖样品制备：灵芝子实体、菌丝体或孢子粉样品按料液比1:100加入85%乙醇提取2次,残渣沸水提取2h,过滤,滤液浓缩至与原料比为1:1,兑水透析后冷冻干燥获得多糖。
1.2.3 单糖组成测定：称取制备的多糖2mg,加入2mol/L的三氟乙酸,于110℃油浴中水解4h。氮吹仪吹干,并多次加入甲醇,反复吹干至无酸味。水解产物用超纯水溶解,离心,并稀释5倍经高效阴离子色谱法测定水解产物中单糖的组成（杨仁智 等2005）。
1.2.4 多糖的HPLC图谱分析：称取制备的多糖样品10mg,用流动相1.5mL溶解,进行HPLC多糖分子量分布特征分析。测定方法参考张忠等（2010）的方法,色谱条件：分析柱选TSK PWXL6000和TSK PWXL3000,凝胶色谱柱串联后分析,流动相为含0.05mol/L的NaH2PO4和0.15mol/L的NaNO3溶液（pH 7,0.02%叠氮钠）,流速为0.5mL/min,色谱柱温用柱温箱恒定在35℃;激光检测器光源波长选用623.8nm。多糖在溶液中的折光指数增量（dn/dc）按照0.146mL/g计算,并使用 Astra（version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA）数据分析软件对光散射数据进行采集和分析,计算分子量。
1.2.5 多糖的酶处理：用两种不同的酶对多糖样品进行处理：1）称取制备的多糖样品10mg,加入配置好的50μmol/mL (NH4)2SO4溶液1.45mL溶解,再加入0.05mL α-amylase酶,40℃水浴20h,之后100℃灭活20min,离心,取上清进行HPLC分析;2）使用0.5mL endo-1,3-β-glucanase酶对多糖样品进行处理,其他步骤同1）。
1.2.6 不同来源多糖对刺激巨噬细胞释放NO产量的影响：称取制备的多糖5mg,用PBS配成0.2、0.5和2mg/mL的溶液,以PBS为空白对照,以LPS为阳性对照,参照乔彦茹（2010）的方法测定对Raw 264.7巨噬细胞释放NO的产量的影响。
2 结果与分析
2.1 多糖含量的比较
运用苯酚硫酸法测定的灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖含量差别明显,其中灵芝菌丝体中多糖含量最高,达到3.81%,孢子粉多糖含量为1.8%,灵芝子实体中多糖含量最低,仅为0.59%（图1）。
图1 各样品中多糖含量比较
Fig. 1 Comparison of polysaccharide content from samples of Ganoderma lingzhi.
2.2 单糖组成的比较
对灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖进行酸水解,结果显示这3种材料水解后单糖组成有较大差别（表1）。灵芝菌丝体多糖主要由葡萄糖组成,含少量的岩藻糖、半乳糖和甘露糖,灵芝孢子粉多糖也主要由葡萄糖组成,比例较菌丝体高,并含少量的半乳糖和甘露糖。子实体多糖则主要由半乳糖和葡萄糖组成,两者比较接近,并含有一定量的岩藻糖。
表1 不同样品多糖的单糖组成
Table 1 Monosaccharide composition of polysaccharides from various samples of Ganoderma lingzhi
样品名称Samples岩藻糖
Fucose半乳糖
Galactose葡萄糖
Glucose甘露糖
Mannose菌丝体 Mycelium119.90.3未破壁孢子粉 Unbroken spore powder---123.60.8子实体 Fruiting body0.2511.070.03
Note: --- Undetected.注：---表示未检测到.
新窗口打开
2.3 HPLC多糖图谱的比较
对灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖进行HPLC指纹图谱分析发现,这3种材料的多糖峰形差别很大（图2）,同时运用Astra数据分析软件对各多糖峰的分子量进行计算（表2）。从图2中可以发现灵芝菌丝体多糖在42min有一个主峰（peak3）,其分子量为1.412×104Da,同时在31min和38min各有一个小峰,分子量分别为9.993×106Da和1.399×105Da。而灵芝孢子粉多糖有3个主峰,出峰时间分别为30min、34min和43min,其分子量分别为1.207×107Da、4.479×105Da和2.259×104Da。灵芝子实体多糖在32min出现第一个峰,峰型较小,分子量为6.413×106Da,第二个峰出峰时间在39min,分子量为4.229×104Da,第三个峰也在43min,分子量为1.153×104Da。从HPLC图谱可以看出3个材料不论是出峰位置还是分子量均有很大的区别。
图2 各样品中多糖的液相图谱 A：菌丝体多糖液相图谱;B：子实体多糖液相图谱;C：未破壁孢子粉多糖液相图谱．
Fig. 2 HPLC chromatograms of polysaccharides extracted from samples of Ganoderma lingzhi. A: HPLC chromatogram of polysaccharides extracted from mycelium; B: HPLC chromatogram of polysaccharides extracted from fruiting body; C: HPLC chromatogram of polysaccharides extracted from unbroken spore powder.
表2 各样品中多糖分子量分布范围
Table 2 Molecular weight distribution of polysaccharides extracted from samples of Ganoderma lingzhi
样品多糖Polysaccharides峰编号
Peak number重均分子量
Weight average
molecular weight Mw (Da)数均分子量
Number average
molecular weight Mn (Da)多分散指数
Polydispersity index
(Mw/Mn)菌丝体
MyceliumPeak1
Peak2
Peak39.993×106
1.399×105
1.412×1043.595×106
9.662×104
1.09×1042.779
1.448
1.296未破壁孢子粉
Unbroken spore
powderPeak1
Peak2
Peak31.207×107
4.479×105
2.259×1048.333×106
3.538×105
1.882×1041.449
1.266
1.201子实体
Fruiting bodyPeak1
Peak2
Peak36.413×106
4.229×104
1.153×1041.787×106
3.317×104
1.017×1043.588
1.275
1.133
新窗口打开
2.4 经酶处理多糖后HPLC图谱的比较
对灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖分别经endo-1,3-β-glucanase酶和α-amylase酶处理后,对HPLC指纹图谱进行分析,初步判断每个样品多糖图谱中峰的构象（图3）。灵芝菌丝体多糖在42min有一个主峰,31min和38min各有一个小峰,31min的峰经endo-1,3-β-glucanase酶处理后消失了,而α-amylase酶作用后未见变化,说明此时出峰的多糖主链应为β-(1→3)-葡聚糖;菌丝体多糖38min出现的峰经α-amylase酶作用后峰高有所下降,而endo-1,3-β-glucanase酶处理后未变化,该多糖主链应是α-构型;而42min出峰的多糖经两种酶处理后都有下降,且α-amylase酶作用后下降更明显,所以在此出峰的多糖主链含有少量的β-(1→3)-葡聚糖。同样的分析得出,在经两种酶处理未破壁孢子粉多糖图谱中,30min时出峰的多糖主链既含有一些β-(1→3)键,也含有一些α-构型;而34min出峰的多糖主链只含有β-(1→3)键;在经两种酶处理子实体多糖图谱中,32min出峰的多糖主链应是以β-(1→3)-葡聚糖为主干,39min出峰的多糖主链含有α-构型。
图3 样品多糖经酶处理后的HPLC图谱 A和D：菌丝体多糖酶处理后的液相图谱;B和E：未破壁孢子粉多糖酶处理后的液相图谱;C和F：子实体多糖酶处理后的液相图谱. ：样品多糖液相图谱;：内切β-1,3-葡聚糖酶处理多糖后的液相图谱;_ _ _ ：α-淀粉酶处理多糖后液相图谱.
Fig. 3 HPLC chromatograms of Ganoderma lingzhi polysaccharides after the enzymatic treatment. A and D: HPLC chromatograms of mycelium polysaccharides treated by the two enzymes; B and E: HPLC chromatograms of unbroken spore powder polysaccharides treated by the two enzymes; C and F: HPLC chromatograms of fruiting body polysaccharides treated by the two enzymes. : HPLC chromatogram of polysaccharides extracted from samples; : HPLC chromatogram of polysaccharides after endo-1,3-β-glucanase treatment; _ _ _ : HPLC chromatogram of polysaccharides after α-amylase treatment.
2.5 各样品粗多糖刺激巨噬细胞NO释放量
对灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖刺激巨噬细胞产生NO的影响进行比较发现（图4）,灵芝菌丝体和子实体具有较好地刺激巨噬细胞的活性,而未破壁孢子粉粗多糖活性较低。
图4 各样品粗多糖对巨噬细胞生成NO的影响 PBS：磷酸盐缓冲液;LPS：脂多糖.
Fig. 4 Effects of crude polysaccharide from different samples of Ganoderma lingzhi on NO release from RAW264.7 macrophages. PBS: Phosphate buffered saline; LPS: Lipopolysaccharide.
3 讨论
本研究结果表明灵芝子实体、菌丝体和孢子粉不仅多糖含量差异较大,在多糖的组成、分子量和对巨噬细胞激活活性等方面均表现出非常大的差异。目前对灵芝子实体多糖的研究报道较多,而有关灵芝子实体、菌丝体和孢子粉化学成分的比较研究较少。在以上3种材料多糖含量进行测定的研究中,邢增涛等（2001）报道多糖含量由高至低依次是菌丝体、孢子粉和子实体,与本研究的结果基本一致。本文对不同材料多糖的单糖组成进行分析,表明不仅是多糖含量,这3种来源多糖的单糖组成也有很大的差异,通过HPLC分析发现这3种材料所含多糖的种类不一致,酶解其链接方式也不一致。通过试验证明3种材料的多糖成分不同。
与李国香等（2009）的方法不同,HPLC分析多糖不仅使用示差检测器,同时运用激光检测器,配合Astra数据分析软件对各多糖峰进行分子量计算,此法测定的多糖分子量更为准确可靠。使用α-淀粉酶和β-1,3-葡聚糖酶处理多糖样品后分析HPLC图谱,可初步判断相应多糖峰的构象,大致了解其相应的链接结构。本文对3种材料中的多糖进行了更为深入的探索,为进一步了解灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中多糖的差异奠定了基础。
参考文献
[1]Cao Y, Wu SH, Dai YC, 2012.Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”.
Fungal Diversity, 56: 49-62[本文引用: 1]
[2]Dai YC, CAO Y, Zhou LW, Wu SH, 2013.Notes on the nomenclature of the most widely cultivated Ganoderma species in China.
Mycosystema, 32: 947-952 (in Chinese)[3]Heleno S, Barros L, Martins A, Queiroz M, Santos-Buelga C, Ferreira I, 2012.Fruiting body, spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal: a comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts.
Food Research International, 46(1): 135-140[4]Li JJ, Lei LS, Yu CL, Zhu ZG, Ma AD, 2007.Immunology study of anti-tumor effect of Ganoderma lucidum polysaccharides.
Journal of Chinese Medical Materials, 30(1): 71-73 (in Chinese)[5]Lin ZB, 2001. Modern Research of Ganoderma. Second edition.Beijing Medical University Press,
Beijing. 1-327 (in Chinese)[6]Liu GQ, Wang XL, 2006.
Structure-activity relationship and anticancer mechanisms of Ganoderma lucidum polysaccharides.
Mycosystema, 25: 430-438 (in Chinese)[7]Qiao YR, Luo YH, Zhou S, Yang Y, Jia W, Tang QJ, Liu YF, Zhang JS, Zhou CY, 2010.Isolation and purification of GFP75-2-2B, a polysaccharide from Grifola frondosa fruit bodies, and its effect on nitric oxide release from macrophages.
Acta Edulis Fungi, 17(4): 48-51 (in Chinese)[8]Xie YZ, Zhang Z, Li SZ, Li C, 2002.Recent advances in the development and processing works of the Ling-Zhi fungus (Ganoderma lucidum).
Journal of Microbiology, 22(6): 43-45 (in Chinese)[9]Xing ZT, Jiang HH, Zhou CY, Yang Y, Bai YQ, 2001.Comparison of crude polysaccharide contents in different Ganoderma lucidum samples.
Edible Fungi, 2001(6): 4-5 (in Chinese)[10]Yang RZ, Zhang JS, Tang QJ, Pan YJ, 2005.High performance anion exchange chromatography method to determine the monosaccharide composition of polysaccharides.
Edible Fungi of China, 24(5): 42-44 (in Chinese)[11]You LJ, Feng MY, Liu JF, Zhao QZ, Luo W, Zhao MM, 2013.Characteristics of Ganoderma lucidum polysaccharide prepared by different methods.
Modern Food Science and Technology, 29(6): 1207-1212 (in Chinese)[12]Zhang JS, Jia W, Xing ZT, Tang QJ, Liu YF, Yang Y, Zhou CY, Liu F, 2004.Comparison of bioactivity of fruiting body and mycelia of Ganoderma lucidum and their purified fractions.
Mycosystema, 23: 85-92 (in Chinese)[13]Zhang XY, Yang CQ, 2006.Chemical components and pharmacologic action of Ling-Zhi (Ganoderma lucidum).
World Phytomedicines, 21(4): 152-155 (in Chinese)[14]Zhang Z, Tang QJ, Zhu LN, Zhou S, Liu YF, Yang Y, 2013.Characterization of polysaccharides extracted from six artificially grown Cordyceps militaris fruit body specimens and their effect on nitric oxide release from macrophages.
Acta Edulis Fungi, 20(2): 28-31 (in Chinese)[15]Zhao LY, Dong YH, Chen GT, Hu QH, 2010.Extraction, purification, characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum.
Carbohydrate Polymers, 80(3): 783-789[本文引用: 1]
[16]戴玉成,曹云,周丽伟,吴声华,2013.中国灵芝学名之管见
. 菌物学报,32: 947-952[本文引用: 1]
[17]李建军,雷林生,余传林,朱正光,马安德,2007.灵芝多糖抗肿瘤作用的免疫学相关性研究
. 中药材,30(1): 71-73[18]林志彬,2001. 灵芝的现代研究. 第二版.北京:
北京医科大学出版社. 1-327
[本文引用: 1]
[19]刘高强,王晓玲,2006.灵芝多糖的抗癌构效关系及其抗癌作用机制
. 菌物学报,25: 430-438[20]乔彦茹,罗永煌,周帅,杨焱,贾薇,唐庆九,刘艳芳,张劲松,周昌艳,2010.灰树花多糖GFP75-2,2B的分离及其对刺激巨噬细胞释放NO的影响
. 食用菌学报,17(4): 48-51[本文引用: 1]
[21]邢增涛,江汉湖,周昌艳,杨焱,白韵琴,2001.不同灵芝中粗多糖含量的比较研究
. 食用菌,2001(6): 4-5[本文引用: 1]
[22]杨仁智,张劲松,唐庆九,潘迎捷,2005.高效阴离子交换色谱法测定毛头鬼伞多糖中的单糖组成
. 中国食用菌,24(5): 42-44[23]谢意珍,张智,李森柱,李崇,2002.灵芝的开发及加工研究新进展
. 微生物学志,22(6): 43-45[本文引用: 1]
[24]游丽君,冯梦莹,刘钧发,赵强忠,罗维,赵谋明,2013.不同提取方法对灵芝多糖性质的影响研究
. 现代食品科技,29(6): 1207-1212[本文引用: 1]
[25]张劲松,贾薇,邢增涛,唐庆九,刘艳芳,杨焱,周昌燕,刘芳,2004.灵芝子实体和菌丝体的提取物及其各纯化组份生物活性的比较
. 菌物学报,23: 85-92[本文引用: 1]
[26]张晓云,杨春清,2006.灵芝的化学成分和药理作用
. 国外医药:植物药分册,21(4): 152-155[27]张忠,唐庆九,朱丽娜,周帅,刘艳芳,杨焱,2013.不同来源蛹虫草子实体粗多糖特征及其刺激巨噬细胞产生NO的活性
. 食用菌学报,20(2): 28-31相关知识
灵芝孢子粉是菌丝体么？灵芝孢子粉的来源和营养价值？
灵芝孢子粉繁殖技术？灵芝怎样繁殖
灵芝孢子粉能否直接繁殖灵芝？
灵芝孢子粉与蜂胶对比 功效成分营养价值等方面的差异
海参和灵芝孢子粉哪个大补？比较海参和灵芝孢子粉的营养价值？
灵芝孢子粉虫草花？正信破壁灵芝孢子粉好不好
灵芝是什么？常见灵芝种类、功效、副作用与牛樟芝差异
食用菌副产物中可再利用的营养成分分析
深度揭露破壁灵芝孢子粉行业黑幕！
灵芝栽培技术培训
网址: 灵芝子实体、菌丝体及孢子粉中多糖成分差异比较研究 https://m.huajiangbk.com/newsview2559180.html
| 上一篇: 世界三宝——中国灵芝的功效及应用 |
下一篇: 陈康林野生药用真菌医学体系研究应 |
