Dev. Cell | 俞皓团队绘制水稻雌蕊单细胞转录组图谱，为发育生物学研究提供新视野
水稻是亚洲地区最主要的粮食作物之一，其籽粒的粗加工产品——大米，为一半以上的人口提供主粮。水稻籽粒是由稻壳覆盖的颖果，其中颖果是种皮果皮愈合的单种子果实，由雌蕊授粉之后发育而来。水稻雌蕊顶端具有分叉的羽状柱头，下部为杯状单室子房，内含一粒胚珠。胚珠表层为数层珠被细胞，中心为单倍体细胞组成的胚囊，二者之间充斥着珠心细胞。受精以后，胚囊发育为子代的胚和胚乳，珠心细胞被消耗，珠被和子房壁愈合，包被覆盖整个种子。双子叶模式植物拟南芥花发育过程中心皮源于第四轮原基（whorl 4），而后心皮内部再分化出很多胚珠；而在水稻花发育过程中，胚珠原基和心皮原基在起始阶段就已经分开，而后二者分别发育为胚珠和包裹胚珠的其他组织。迄今为止，水稻雌蕊的细胞构成及其特征还未有详细分析。水稻雌蕊作为花发育最终产物之一，也是后续种子发育的前体器官，在单细胞层面了解其发育模式及基因表达特征对了解水稻世代交替和种子发育中的调控机理至关重要。
近日，新加坡国立大学俞皓教授研究组在 Developmental Cell 在线发表了题为“ Single-nucleus sequencing deciphers developmental trajectories in rice pistils ”的论文，通过单细胞核测序首次展示了水稻雌蕊的单细胞转录组图谱。
由于水稻雌蕊不易裂解制备原生质体，该组采用单细胞核测序策略，选取即将于次日开花的一段花序，采集一系列处于不同发育阶段的雌蕊用于制备细胞核，并通过流式细胞术分选，获得了纯化的二倍体细胞核和潜在的单倍体细胞核，并将两类细胞核分别进行单细胞测序。由于水稻雌蕊中没有已知的细胞类型特异标记基因，该组通过大量的原位杂交试验对细胞群潜在标记基因进行了逐一验证，进而对雌蕊的细胞类型进行了全新注释（图1）。数据显示，水稻雌蕊的细胞明显分为两个大类，根据已知花发育身份基因的映射分析，这两类细胞分别对应心皮原基和胚珠原基来源的细胞。同时，通过将本数据组和已发表的水稻花序单细胞数据组、拟南芥花顶端分生组织单细胞核数据组进行比较，该组观察并描绘了水稻雌蕊中不同细胞类型与同种/异种相关组织细胞间的关系，从侧面验证了细胞类型全新注释的准确性。
图1 水稻雌蕊单细胞图谱提供发育生物学新视野
研究人员进一步对心皮原基和胚珠原基来源的细胞进行发育轨迹分析。胚珠原基来源细胞的轨迹分析显示出“一枝两叶”的结构，其中“两叶”路径分别展示了合点相关细胞（chalazal cells）和珠被（integument）分化的路径。而根据二倍体细胞群和流式分选的单倍体（1N）细胞的对比，发现主干路径（“一枝”）主体为珠心细胞，且与单倍体细胞相关性最高，暗示了“一枝”路径为雌配子体发育路径。值得注意的是， 通过比较graph-based轨迹分析工具（Monocle3）和另一发育分析工具（CytoTrace）对主干路径（“一枝”）的拟时分析结果，珠心到雌配子体发育路径中基因表达的多样性上升。据此推测作为发育末端的珠心细胞在参与配子体产生过程中发生了多能性重置。对雌蕊剖片的离体培养也显示珠心细胞相较于雌蕊其他细胞更易于脱分化，可以产生全能性恢复的愈伤组织，从而从侧面验证了此假设。
另外，心皮原基来源细胞的轨迹分析显示两次主要的轨迹分叉。第一次轨迹分叉发生在轨迹起始处，将表皮细胞发育路径和其他细胞分化路径分开。原基早期的发育分叉往往导致后期组织细胞在空间上的分离。细胞学观察也验证了此假设，即典型的表皮细胞仅仅覆盖雌蕊下部的子房部分，花柱和柱头均没有典型的表皮覆盖。第二次轨迹分叉分离出成熟的柱头细胞（cluster 5）和另一类细胞（cluster 6）。功能富集分析显示cluster 6细胞富集光合作用相关基因，而碘染实验证实了花柱基部、子房顶部的皮质细胞（cortext cells）确实富含淀粉（光合产物），而该区域与cluster 6标记基因的原位杂交表达区域一致。此外，第二次轨迹分叉处的细胞富集钙信号相关基因。鉴于该轨迹分叉与柱头（cluster 5）相关，因而推测钙信号与柱头发育后期过程相关。外施钙通道特异抑制剂GdCl 3 和LaCl 3 可以促进柱头分支打开，帮助柱头外露，证实了钙信号在柱头后期发育和功能发挥中具有重要功能。
综上，此项研究首次描绘了单子叶植物雌生殖器官的单细胞图谱，并鉴定了水稻雌蕊不同细胞类型的标记。利用该图谱，可以从更细致的角度解析水稻雌蕊的发育特征，并从中发掘发育过程中的未知属性。同时，该研究为在单细胞水平探索不易获取原生质体或没有已知标记的植物组织提供了很好的研究范式（图2）。
图2 细胞核单细胞图谱研究范式
新加坡国立大学俞皓课题组的李骋翔博士和张松瑶博士为论文共同第一作者，阎星颖博士和程鹏博士参与了本项研究，俞皓教授为通讯作者。本研究项目得到了新加坡食品局，新加坡国立大学和淡马锡生命科学研究院的支持。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.03.004
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