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花粉自清除CRISPR/Cas创制系列同型株高变异品种

花匠小妙招
2024-10-26 07:29

CRISPR/Cas基因编辑具有靶向精准、操作简便、突变类型丰富、应用范围广、效率高等突出优势，已成为农作物遗传改良的主要技术工具。当前，通过稳定遗传转化CRISPR/Cas是植物基因编辑的主要途径。然而，有性繁殖植物中，转基因元件可通过植物的花粉向自然与农业环境中扩散传播。玉米是典型的异交授粉植物，一个单株可产生200万至500万粒花粉(Goss, 1968)，可能带来非预期的生物安全管理风险。前人已报道了一种“自杀式”转基因策略，可以产生无转基因的基因编辑植物以解决转基因扩散问题，对无性繁殖植物因无减数分裂重组以去除转基因成分，该方法也是理想的生物安全管理解决方案(He et al., 2018)。然而，有多个基因编辑生物育种技术场景仍需活体中保持CRISPR/Cas存在，持续发生基因编辑靶向突变活性。 因此，研发一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术，尤为必要。此外，玉米是世界上主要的粮食作物，紧凑矮杆等耐密株型遗传改良是当代玉米遗传与育种主要方向(Tian et al., 2019)，降低株高具有抗倒、增密增产等农学意义。以某个特定的品种为“底盘”，创制系列降低株高同型衍生品种，对扩大该品种适应生态区域与生产应用推广，具有重要价值。

https://doi.org/10.1016/j.xplc.2023.100637

2023年6月10日， 中国农科院作物科学研究所联合西北农林科技大学等多家单位在 Plant Communications在线发表了 “Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize” 的研究论文。该研究成功开发了一种花粉自清除CRISPR/Cas ( PSEC )靶向多个生长调节因子-GRF，通过引入花粉特异表达的能量耗竭元件，成功实现了含有 PSEC 元件的单倍体花粉不育，导致玉米植株世代稳定维持 PSEC 元件半合子杂合体， PSEC 仅能通过雌性配子体向下一代遗传。研究表明，玉米植株中 PSEC 可跨世代保持高效的靶向 ZmGRF1 、 ZmGRF5 和 ZmGRF6 基因编辑活性，基于同一个材料创制出系列株高版本的同型衍生品系。

图1.花粉自清除CRISPR/Cas靶向 ZmGRFs 基因编辑与系列矮杆衍生品系创制

研究者对编码3种生长调节因子 ZmGRF1 、 ZmGRF5 和 ZmGRF6 的基因设计与构建了 PSEC ，在 PSEC 中引入了此前该团队已成功应用的一个花粉特异的α-淀粉酶基因 ZmAA1 表达盒(Qi et al ., 2020)，导致玉米植株世代稳定维持 PSEC 元件半合子杂合体 PSEC（+/-）。 PSEC（+/-）孢子体发生时，会产生 PSEC（+）和 PSEC（-）两种单倍体配子体，而 PSEC（+）花粉彻底不育， PSEC 仅能通过雌性配子体向下一代遗传。

该研究通过农杆菌介导的玉米幼胚稳定转化，获得了多个遗传转化事件。为了获得可靠的遗传分离数据，采用数字液滴PCR筛选到2个 PSEC 单拷贝转基因事件，并集中分析单拷贝转基因事件株系3-1。通过花粉KI/I2染色、花粉与籽粒 PSEC PCR、后代植株与籽粒PCR等分析，发现 PSEC 单拷贝转基因事件符合预期分离比。从T2株系群体中，筛选得到纯合的 ZmGRF1 、 ZmGRF5 和 ZmGRF6 所有可能的单、双和三突变组合，相比于原始品系，突变株系发生了不同程度株高的降低，该完整系列的 Zmgrf1 、 Zmgrf5 和 Zmgrf6 单个与复合突变体既可用于基因功能研究，也可用于育种。为了研究跨世代遗传靶向突变活性，研究者以 PSEC（+/-）分别作为花粉供体或受体，与3个玉米自交系JD96M、JD96F和B73杂交，并分析了后代靶向突变。结果显示， PSEC 只能通过雌配子遗传并保持了很高效率的靶向突变活性，在17.5%至95%的F1种子中发现了在 ZmGRF1 、 ZmGRF5 和/或 ZmGRF6 单个或复合突变基因型。

该研究开发了一种既没有花粉扩散转基因风险，又能保持基因编辑元件稳定遗传，且保持高编辑活性的技术的基因编辑技术，该技术适用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技术；该研究同时还创制了靶向 ZmGRF 获得特定品种系列矮杆同型衍生品种技术，为矮杆育种提供了新的技术策略和解决方案，具有种业应用潜力与价值。

中国农业科学院作物科学研究所与西北农林科技大学联合培养的博士生 王虹麟为该论文的第1作者， 谢传晓研究员和杨琴教授为论文共同通讯作者, 李新海研究员等具体指导与参与了该研究。该研究得到了国家重点研发计划G2P项目、国家玉米产业技术体系、河南省农业农村厅和海南崖洲湾种子实验室等资金资助。

参考文献：

Goss, J.A. (1968) Development, physiology, and biochemistry of corn and wheat pollen. 34, 333–359.

He, Y., Zhu, M., Wang, L., Wu, J., Wang, Q., Wang, R., and Zhao, Y. (2018) Programmed self-elimination of the CRISPR/Cas9 construct greatly accelerates the isolation of edited and transgene-free rice plants. Mol. Plant, 11, 1210–1213.

Qi, X., Zhang, C., Zhu, J., Liu, C., Huang, C., Li, X., and Xie, C. (2020) Genome editing enables next-generation hybrid seed production technology. Mol. Plant, 13, 1262–1269.

Tian, J., Wang, C., Xia, J., Wu, L., Xu, G., Wu, W., et al. (2019) Teosinte ligule allele narrows plant architecture and enhances high-density maize yields. Science, 365, 658–664.

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