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生物技术在种植业中的应用与实践-8

花匠小妙招
2024-10-29 01:11

第二节微生物体生物农药液固双相发酵生产工艺简介

液固双相发酵是将经液体发酵培养出菌丝或芽生孢子后接种至固体培养基上进行固体发酵产生分生孢子的方法，包括液体发酵和固体发酵2个阶段。液固双相发酵充分结合了两者之长，利用液体发酵快速生产大量的菌丝体或芽生孢子，再转到固体营养或惰性基质上使其产生最接近自然接种体形态的气生分生孢子。该方法最大限度地利用了液体培养的优点，先生产大量的菌丝或芽生抱子，缩短了菌丝生长周期，也避免了前期污染的向颗，生产方法简便，能耗和成本低，同时固相发酵产品克服了液相发酵所产芽生抱子环境稳定性差等缺点，因此被广泛用于杀虫真菌的批量生产。

一、培养基质

大规模发酵生产的真菌分生孢子主要以大米、小麦和米糠为基质。其中大米及其大米副产品广泛应用于微生物体生物农药发酵的培养基质。但是，当大米单独使用，大米颗粒较大的表面积限制了真菌的利用空间，如果单独使用底物，就需要引进一种增加水和空气利用率的介质。据报道，甘蔗渣和固体发酵底物的混合使用能够促进水利用率进而促进真菌的生长。到目前为止，最经常使用的培养菌体分生孢子的基质是大米。这是基于多种因素的考虑，包括营养平衡、费用、利用的地域性、颗粒大小形状、接种真菌后的湿度和颗粒完整性等物理性质。

二、影响因素

包括影响液体深层发酵和固体发酵的因素。张丽萍等对真菌的液固双相发酵条件进行了初步的研究，确定了培养真菌的培养基、培养温度、含水量、培养时间和初始pH值。农向群等研究了昆虫病原真菌绿僵菌R8-4菌株液固两相法培养过程中固相培养阶段的条件，包括培养基载体、接种量、接种后基质含水量、培养过程中的温度、光照、通气量等因素对产抱量的影响。结果表明，蛭石和稻壳均可作为固相培养的优良载体，以蛭石为载体的产量稍高于稻壳。玉米粉和麦组合是该菌的良好营养源，与不同载体配合均可使产抱量达到20x 10⁸孢子/克以上。以小米提供营养的不如麦加玉米粉，当小米与载体的质量比大于3:1可获得 15x10⁸孢子/克的产量。

三、应用情况

国外报道以水稻或谷子为基质用液固双相系统生产的黄绿僵菌，可得到100克/千克孢子的产量。这种方法首先是在蔗糖/酒酵母介质中接种孢子并于摇瓶中生长，3天后将液体培养基转人高压灭菌的大米中，通过开袋通风，10~14天后用过筛法将孢子分离出来，干燥后抱子的湿度可达25%，然后在低温下保存国外研究员Jenkins和Lomer将用糖液培养2天、3天的绿僵种子液接种到布料上，垂直悬挂在无菌钢盒中，9天后布料的两面均长满分生抱子，产抱量达3x 10⁸个/厘米。Jenkin等人以t米为培养基质，用液固双相系统生产黄绿僵菌，平均产量达1.5x10⁹个/克。虽然有的研究者认为这种发酵系统不适合大规模的生产，要提高孢子的产量只能通过增加成本和劳动力，但是这种简单的劳动密集型发酵系统比较适合中国市场的需要。

液体深层发酵得到的芽生孢子寿命短且活力弱，而固体发酵虽可得到分生孢子，但是其生产周期长、菌剂含量低而导致成本高的弊端同样阻碍了实用化进程。利用液固双相发酵工艺仅用两种廉价、易得的农副产品为原料，控制适当的培养条件，能得到高含量的孢子粉。液固双相发酵综合了液体发酵和固体发酵的这两者的优势:①提高培养真菌的竞争力，降低杂菌的感染。②提高真菌产生孢子的速度，降低真菌的培养时间和使用空间。③液体培养阶段对可能受杂菌污染种子斜面培养基的做进一步筛选。④确保接种菌液对固体颗粒物质的均匀覆盖，使菌体能同步生长。

第五章国内外生物农药产业发展现状与趋势

第一节国际生物农药产业发展现状与趋势

美国是全球最大的生物农药市场，美国联邦环保署 (EPA)新批准的生物农药数量远超过常规农药。欧洲是全球增长最快的生物农药市场，保持着15%的高增长率。据预测，到2015年，全球生物农药的市值有望达28亿美元。目前，国际上有27个国家已将46种微生物列为微生物杀菌剂的有效成分。其中真菌类25种，细菌类21种。在美国、欧盟、英国、新西兰、南非、澳大利亚、加拿大、印度等国家和组织认证的微生物菌株有53个，并登记了相关产品，已广泛应用于农业、林业、园林和食品生产实践中。其中，美国已有26个微生物菌株进行了微生物农药登记，登记产品85个。主要公司包括美国生物农药公司AgraQuest(登记产品22个)、美国拜沃股份有限公司 (登记产品8个)、拜耳公司(登记产品7个)等。美国生物农药商MBI公司的生物杀虫杀端剂Grandevo的干粉剂型已经获美国环保署批准登记。这个杀虫剂提取自一种subtsugae色素细菌的一个菌株，菌株代号为PRAA4-1T，Grandevo抗虫谱相当广，能防控包括木虱、蓟马、粉、潜叶蛾、椿象、草盲、稻叶甲、白蜻、黏虫等多种害虫。它具有触杀和抵制的双重作用机制，使得害虫难以产生抗性，比单一机制的产品有了更多的优势，特别适用于病害综合治理体系，减少害虫对常规化学农药产生抗性和控制残留问题。

该产品安全性高，不受施用/收获时间间隔限制，施用后再进入用药区域的间隔期短，还没有最高残留限制，符合国家有机种植计划(NOP)，还被列人了OMRI清单，可以在田地、温室和花园中施用。Marrone Bio Innovations公司提交的产品是生物杀虫剂/杀端剂MBI-206EP (伯克霍尔德氏菌A396菌株，94.5%)，可用于防控草皮，观赏性植物和可食用作物中的鳞翅类害虫，比如苹果小卷蛾、黏虫、木虱和六点叶等。美国AgraQuest公司的生物杀菌剂Serenade (枯草杆菌QST713菌株)已在加利福尼亚州登记获批用于草莓作物，该产品可替代澳甲烷填补熏蒸剂澳甲烷的空白，在控制土壤疾病方面表现优异，还能为种植者带来相当可观的产量提升，且相比使用土壤熏蒸剂需要耕地清场30天之久，Serenade只需要4天即可，国际市场每年对甲烷的需求量超过5亿美元，Serenade还获英国批准用于马铃薯沟施。据康涅狄格大学的研究显示，枯草芽孢杆菌在作物根系周围的存留期超过80天，使用Serenade Soil杀菌剂平均可以提高13%的产量该产品将成为世界第三大土壤杀菌剂，其对丝核菌的防控，效果优于传统农药喀菌醋 (Amistar) 70%，且价格比后者更具优势据世界农化网中文网报道，美国环保局2013年提议批准BeckerUnderwood公司生物杀菌剂Integral F-33产品(有效成分:短小芽孢杆菌菌株BU F-33)使用于诱导多种作物(如胡萝卜、番茄)系统抗性的室内商业化种子处理。Becker underwood已申请该杀菌剂对所有食品最大残留豁免。美国环保局2013年已经批准Summit Chemical公司的生物杀虫剂产品Summit Bti MP(有效成分:苏云金杆菌以色列变种菌株SUM-6218)投入生产，此新活性成分与苏云金杆菌以色列变种极其相似。

德国的拜耳作物科学公司于2012年8月高调宣称以4.25美元成功地收购了美国AgraQuest生物技术公司，随即推出了Serenade品牌的生物农药，瑞士的先正达公司以1.13亿美元收购polera生物科学公司:德国的巴斯夫公司以10.2亿美金计划收商Beck Underwood生物科学公司，这些世界级的农药公司通过收购生物科技公司来进入和领军生物农药行业、带动了全球农代巨型企业积极争相收购生物科技公司、极大地促进了生物农药的快速发展。美国生物农药行业协会执行会长Stoneman认为全球农化巨头积极争相收购或并购生物科技公司，将进一步促进新型生物农药创制和生物农药市场的推广应用，推动生物农药行业的健康可持续发展。

2013年1月，德国拜耳作物科学公司继续收购动作，收购了德国的Prophyta GmbH生物科学公司，不但收购该公司的新产品、新专利，还收购该公司的研发实验室及新制剂规模生产企业。Prophyta GmbH公司成立于1992年，总部位于德国，是-家利用微生物源生物制品提供植物保护产品的公司。该公司主要品牌是防控菌核病的ContansTM及杀线虫剂BIOACTTM，研发的产品已在全球30多个国家取得登记许可。经过这次收购，拜耳公司产品开发经理Jennifer Riggs表示，拜耳将拓展在新鲜水果和蔬菜生产、种子处理等领域的生物农药新产品创制与应用业务。此外，拜耳公司通过收购以色列的生物农药公司AgroGrenn的坚强芽孢杆菌技术，开发特定产品，使之成为生物杀线虫种子处理剂，以商品名为Votivo的新产品推出并进入市场。随后开发出另一产品，作为组合种子处理剂Poncho Votivo (塞虫胺+坚强芽胞杆菌)在2012年成功进入全球市场。

巴斯夫公司目前在研发化学农药与生物农药的组合产品来推出适应市场需求的农作物病虫害有效的解决方案。该公司认为生物农药与化学合成农药就药效相比还有差距，但通过生物农药与化学农药组合成的新产品，会使农民从中获益。如其中一项较好的方案是采用化学和生物植保产品组合的喷雾项目。农民在收获果蔬前喷洒传统的产品，然后在收获前关键期换成生物产品，提供给农民残留控制和抗性管理双重效益。巴斯夫公司通过收购Becker Underwood生物科技公司，强化了在农药领域中的竞争优势，特别是高速增长的种子处理市场。随即，巴斯夫公司与巴西农业研究院签订了长达五年的合作协议，重点开发生物农药巴斯夫的作物保护部门将新推出一个叫做功能性作物保护部门的全球战略性业务。这个部门将整合巴斯夫与Becker Underwood现有的种子处理、生物学作物保护、作物健康以及水分和营养管理方面的研究，开发和营销活动。Becker Underwood的动物营养业务将被整合到巴斯夫的营养&健康部门下。2012年12月巴斯夫从位于美国的私募股权投资公司Norwest Equity Partners处完成对Becker Underwood的收购。通过此次收购，巴斯夫顺利成为生物种子处理技术以及种子处理着色剂和聚合物的全球领先供应商。同时，巴斯夫的产品库得到进一步丰富，增加了生物植保产品、草坪和园艺用产品、动物营养产品和景观着色及包衣产品等。先前巴斯夫与美国生物农药公司AgraQuest合作，获得了遍及拉丁美洲及其他地区的销售权，枯草芽孢杆菌菌株QST713和信息素Cetro在巴西首次上市。

先正达公司认为生物农药对种植者的吸引力越来越大，逐步成为有效防控虫害、减缓抗性问题以及残留控制方面新增的选择项。近年来，该公司将生物农药视为其战略的一部分，与多家公司在生物防治领域建立合作伙伴关系，并寻找更大规模的投资合作机会。先正达对Pasteuria公司的收购，丰富了先正达杀线虫产品库，利于为大豆、玉米、谷类作物、甜菜和蔬菜等主要农作物提供整套综合解决方案。随即，先正达与MBI签署了欧洲、中东和非洲等地区的分销协议，先正达的创投子公司成为MBI融资2540万美元的主要投资者之一。同时，先正达公司和诺维信公司达成Taegro全球销售和分销独家授权协议。从2011年起，先正达公司又与Pasteuria Bioscience公司成为了全球技术合作伙伴，共同开发以土壤细菌巴斯德杆菌为基础的生物杀线虫剂。先正达称将继续寻找有前景的生物农药来投资并寻求合作。

孟山都公司认为新型生物农药将成为世界各国农业生产者的病虫害防控有效工具，该公司称其对探索新的防虫药剂感兴趣.并开始通过合作和自身的努力在这一领域进行工作研究。在2010年与AgraQuest公司订立一项为期3年的合作，评估生物农药的生产线对孟山都公司核心作物和蔬菜种衣剂开发的潜在用途。该公司还与拜耳签订了有关种植剂PonchoVotivo的协议，以供孟山都公司在美国的玉米和大豆种植剂等应用。

统计显示，全球传统农药市场的年销售额在470亿美元，而六大农药公司占据了其中75%的市场份额。相比之下，全球生物农药市场在2011年达到13亿美元后，预计2020年之前将达到28亿美元。但整个生物农药市场由100多号中小企业分割，高度分散，许多公司往往仅有一两种产品，不利于生物农药行业的壮大和规模化发展。

生物农药发展已进入“生物信息技术”时代，以发现新先导化合物和验证新型药物靶标为重要目标的新药物创制得到了蓬勃发展。基因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学等前沿技术与生物农药研究的紧密结合，化学、物理学理论和结构生物学、计算机和信息科学等基础学科与药物研究的交叉和渗透，使农业生物药物研究、开发和应用的深度和广度不断拓展。产品剂型由短效向长效发展，从不稳定向稳定发展，从效果单一向多样化发展。

分析未来的发展趋势，仅就微生物杀虫剂而言，将有如下四大突破，第一是利用基因重组技术对微生物杀虫剂的来源生物进行特性改良 (包括毒力选择性和安全性等)，或直接将抗虫基因转入植物体内，这一技术目前在生物农药领域的研究和开发上已得到较广泛的应用，如在重组Bt和重组昆虫病毒领域。第二是将微生物杀虫剂与低毒的化学农药或增效因子混配使用，以增强作用效果。第三是在微生物农药的后加工处理过程加人安全型辅助剂，使产品不被紫外线和氧化等作用所破坏，能延长储藏期，维持特定的物理特性如分散度和黏附靶标作物的能力等。第四是通过发酵工艺和反应器的改良来提高发酵液效价，降低微生物农药的生产成本。

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