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多花芍药（Paeonia emodi）种子超低温保存及含水量对生活力影响的作用机制研究

花匠小妙招
2024-10-31 06:29

【摘要】： 超低温保存是生物种质保存技术之一,具有永久保存种质的潜力。含水量是影响种子生活力和超低温保存效果的重要因素,其在适宜范围内时超低温保存后才具有较高的生活力。但是不同含水量种子如何影响超低温保存生活力的机制目前并不完全清楚。本文在野生多花芍药(Paeonia emodi)种子超低温保存技术程序研究基础上,研究了不同含水量种子在超低温保存前后其氧化应激和细胞程序性死亡(PCD)的发生情况;并通过外源添加H_2O_2和Ca~(2+)调节剂,研究内源Ca~(2+)和H_2O_2的变化对氧化应激和PCD的影响,探究不同含水量种子超低温保存后的生活力差异的机制。主要研究结果如下:(1)自然采收的多花芍药种子生活力与含水量呈正比,含水量在21.36%～8.77%时种子生活力之间无显著差异,为98.89%～97.74%;但当种子含水量为7.07%～3.72%时,降为82.22%～0.00%。常温下多花芍药种子安全含水量临界值为8.77%。(2)多花芍药种子含水量控制在8.77%,直接冷冻或缓慢冷冻,超低温保存后生活力可达97.80%,自来水化冻或水浴化冻后生活力分别为95.48%和97.82%,但差异不显著。采用该技术程序液氮保存种子90 d后,其生活力为96.67%,与自然采收的种子生活力无显著差异。(3)多花芍药种子含水量降低至7.07%时,种子中ROS含量显著上升,MDA含量增加,生活力显著降低至82.22%,但此时PCD相关指标并未显著升高,表明常温下种子含水量降低导致的生活力下降的主要原因是发生细胞膜脂过氧化。(4)多花芍药种子在适宜含水量(8.77%)进行超低温保存时,MDA含量增加不明显,PCD相关指标未有显著变化,且种子的超微结构未发生明显变化。较高含水量种子(21.36%、18.33%)超低温保存后,O_2~-、·OH、H_2O_2含量均增加,且与MDA含量的变化一致,其中O_2~-浓度与MDA含量呈极显著正相关;超微结构显示典型的PCD发生特征,质壁分离明显,细胞膜破裂,细胞质内物质外泄,且细胞核皱缩,核质比显著降低;同时凋亡酶活性显著增加,线粒体膜电位下降明显等。表明种子较高含水量种子超低温保存时,生活力降低是种子内的O_2~-介导的膜脂过氧化反应与PCD途径共同导致种子生活力降低。(5)外源H_2O_2(50 mmol/L)提高了各种含水量种子超低温保存后的内源H_2O_2含量,加深了细胞膜脂过氧化程度;促进了PCD的发生,导致种子生活力显著降低了37.07%～50.70%。而外源抗氧化剂As A(7.5μmol/L)降低了超低温保存后种子内源H_2O_2含量,缓解了细胞膜脂过氧化程度,显著降低了Caspase-3 like活性,一定程度上抑制了PCD发生,提高了种子生活力。表明H_2O_2通过介导氧化膜损伤和诱导PCD发生导致种子生活力降低。(6)外源添加Ca Cl_2(100 mmol/L)提高了超低温保存后种子内源Ca~(2+)含量,促进了PCD发生;显著提高了种子的·OH产生能力。外源钙离子螯合剂EGTA(50μmol/L)降低了种子内源Ca~(2+)含量,抑制了PCD发生,显著降低了高含水量种子(18.33%和21.36%)MDA含量,缓解了较高含水量种子的细胞膜脂过氧化程度,种子生活力分别增加了50.03%和30.08%。表明含水量通过改变Ca~(2+)浓度以及ROS含量影响PCD和细胞膜脂过氧化程度,从而影响种子生活力。本研究确定了多花芍药种子超低温保存技术程序;阐明常温下多花芍药种子含水量变化通过影响细胞膜脂过氧化影响生活力。而种子超低温保存中是通过影响细胞膜脂过氧化和PCD等途径共同影响种子生活力,其中H_2O_2和Ca~(2+)在这两种途径中起关键作用。

【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2021

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