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一种石斑鱼用中草药免疫增强剂及其制备方法和应用

花匠小妙招
2024-10-31 19:31

1.本发明涉及水产品养殖技术领域，特别是涉及一种石斑鱼用中草药免疫增强剂及其制备方法和应用。

背景技术：

2.石斑鱼是我国南方重要的海水网箱养殖经济鱼类，具有生长快速、抗病性强、肉质鲜美、营养价值高、适合大规模养殖等特性，深受市场的欢迎。近年来，由于过度追求养殖效益，养殖环境逐渐恶化，病害问题频繁发生。哈维氏弧菌(vibrio harveyi)是石斑鱼弧菌病的主要病原，常引起患病鱼深层皮肤溃疡、胃肠疾病和眼部病变，导致石斑鱼的发病率和死亡率升高，造成重大经济损失。
3.目前在石斑鱼养殖中主要应用抗生素治疗弧菌病，但抗生素的滥用导致耐药细菌的出现和药物残留等生态问题，影响石斑鱼的食用安全。疫苗对石斑鱼弧菌病的预防虽然具有特异性效果，但要大规模推广应用存在一系列技术瓶颈，如：注射法操作费时费力，难以推广应用(尤其是海水网箱养殖)；口服疫苗存在生产技术不成熟和生产成本高等问题。
4.中草药作为绿色天然药物，具有毒副作用小、多组分多靶点多功效、不易诱发病原菌耐药、低污染、价格低廉、资源丰富等优势，可用于水产养殖的病害防治等领域。目前用于水产疾病防治的中草药作为免疫增强剂或抗病原药物，在饲养期间，还存在平均饲料系数高、存活率低、免疫保护效果不理想的问题。如专利cn106540157a提供了一种石斑鱼用复合中草药免疫增强剂，原料组成为：菊花粉10％，山苏粉8％，海藻粉10％，桑叶粉8％，胡萝卜粉10％，辣木粉8％，仙鹤草5％，紫苏7％，黄芪5％，土茯苓5％，鱼腥草3％，百部5％，金银花3％，白术5％，防风3％，大蒜素3％，低壳聚糖0.5％，铁皮石斛1.5％。该专利的石斑鱼养殖结果显示饵料系数较高，石斑鱼血清中超氧化物歧化酶活力偏低，石斑鱼的抗病能力有待进一步提升。因此，开发绿色、安全、免疫效果优异的植物性中草药免疫增强剂就具有十分重要的意义。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种石斑鱼用中草药免疫增强剂及其制备方法和应用，本发明制得的中草药免疫增强剂对石斑鱼具有显著的促生长和抗病效果，而且使用方便，能够作为饲料添加剂使用，克服了现有海水养殖石斑鱼弧菌病防治方法的缺陷和不足。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种石斑鱼用中草药免疫增强剂，包括以下重量份的原料：熟地黄5
‑
15份、绿豆10
‑
30份、葛根5
‑
20份、茯岺1
‑
10份、甘草1
‑
10份、郁金1
‑
10份、白术1
‑
10份、石菖蒲5
‑
15份、合欢花1
‑
10份、连翘1
‑
10份、蒲公英5
‑
20份、龙眼核5
‑
10份、木香1
‑
10份、山楂1
‑
15份。
8.进一步地，包括以下重量份的原料：熟地黄8
‑
10份、绿豆15
‑
20份、葛根10
‑
15份、茯岺5
‑
8份、甘草5
‑
7份、郁金4
‑
6份、白术4
‑
7份、石菖蒲6
‑
10份、合欢花5
‑
8份、连翘4
‑
6份、蒲公
英8
‑
12份、龙眼核7
‑
9份、木香7
‑
9份、山楂8
‑
12份。
9.本发明提供一种所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：将熟地黄、绿豆、葛根、茯岺、甘草、郁金、白术、石菖蒲、合欢花、连翘、蒲公英、龙眼核、木香和山楂14种中草药分别粉碎，并按比例混合均匀，得到所述石斑鱼用中草药免疫增强剂。
10.进一步地，所述粉碎的粒径要求为过100目筛。
11.本发明还提供一种所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂作为饲料添加剂的应用。
12.进一步地，在石斑鱼饲料中添加所述中草药免疫增强剂，所述中草药免疫增强剂占石斑鱼饲料质量的0.5
‑
2％。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明提供了一种石斑鱼用中草药免疫增强剂及其制备方法和应用，本发明将各种单方中草药进行合理配伍后，起到了协同增效的作用，制备得到的中草药免疫增强剂对石斑鱼具有显著的促生长和抗病效果，而且使用方便，能够作为饲料添加剂使用。
15.在石斑鱼配合饲料中添加0.5
‑
2％的中草药免疫增强剂，喂养期28天，结果显示：在基础饲料中添加1.5％的中草药免疫增强剂，试验组石斑鱼的增重率和成活率最高、饲料系数最低；石斑鱼血液中的白细胞吞噬率、血清中的超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活力、抗菌活力等免疫指标显著高于对照组，肠道中的双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的数量显著高于对照组，而大肠杆菌、弧菌等致病菌的数量显著低于对照组。石斑鱼经人工注射感染哈氏弧菌后，其免疫保护率为74.16％。说明本发明所提供的中草药免疫增强剂可以显著改善石斑鱼的肠道菌群结构，提高石斑鱼的免疫功能和抗弧菌感染能力，提高养殖成活率。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道细菌总数的影响；
18.图2为中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道弧菌数量的影响；
19.图3为中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道大肠杆菌数量的影响；
20.图4为中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道乳酸菌数量的影响；
21.图5为中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道双歧杆菌数量的影响；
22.图6为中草药免疫增强剂对石斑鱼血液白细胞吞噬率的影响；
23.图7为中草药免疫增强剂对石斑鱼血清溶菌酶活力的影响；
24.图8为中草药免疫增强剂对石斑鱼血清sod活力的影响；
25.图9为中草药免疫增强剂对石斑鱼血清抗菌活力的影响；
26.图10为中草药免疫增强剂对石斑鱼免疫保护率的影响。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.实施例1
33.取熟地黄10份、绿豆20份、葛根10份、茯岺5份、甘草5份、郁金5份、白术5份、石菖蒲10份、合欢花5份、连翘5份、蒲公英10份、龙眼核8份、木香5份、山楂10份，分别粉碎过100目筛并混合均匀，得到石斑鱼用中草药免疫增强剂。
34.实施例2
35.取熟地黄5份、绿豆30份、葛根5份、茯岺10份、甘草1份、郁金10份、白术1份、石菖蒲15份、合欢花1份、连翘10份、蒲公英5份、龙眼核10份、木香1份、山楂15份，分别粉碎过100目筛并混合均匀，得到石斑鱼用中草药免疫增强剂。
36.实施例3
37.取熟地黄15份、绿豆10份、葛根20份、茯岺1份、甘草10份、郁金1份、白术10份、石菖蒲5份、合欢花10份、连翘1份、蒲公英20份、龙眼核5份、木香10份、山楂1份，分别粉碎过100目筛并混合均匀，得到石斑鱼用中草药免疫增强剂。
38.实施例4
39.取熟地黄8份、绿豆20份、葛根15份、茯岺5份、甘草7份、郁金4份、白术7份、石菖蒲6份、合欢花8份、连翘4份、蒲公英12份、龙眼核7份、木香9份、山楂8份，分别粉碎过100目筛并混合均匀，得到石斑鱼用中草药免疫增强剂。
40.实施例5
41.取熟地黄10份、绿豆15份、葛根10份、茯岺8份、甘草5份、郁金6份、白术4份、石菖蒲10份、合欢花5份、连翘6份、蒲公英8份、龙眼核9份、木香7份、山楂12份，分别粉碎过100目筛并混合均匀，得到石斑鱼用中草药免疫增强剂。
42.对比例1
43.同实施例1，区别在于，未添加熟地黄。
44.对比例2
45.同实施例1，区别在于，未添加葛根和郁金。
46.对比例3
47.同实施例1，区别在于，未添加茯岺。
48.对比例4
49.同实施例1，区别在于，未添加石菖蒲。
50.对比例5
51.同实施例1，区别在于，未添加甘草和连翘。
52.对比例6
53.同实施例1，区别在于，未添加蒲公英。
54.对比例7
55.同实施例1，区别在于，未添加龙眼核。
56.对比例8
57.同实施例1，区别在于，未添加木香。
58.对比例9
59.同实施例1，区别在于，将甘草替换为金银花。
60.对比例10
61.同实施例1，区别在于，将合欢花替换为菊花粉。
62.试验例1
63.将实施例1的石斑鱼用中草药免疫增强剂按0.5％、1.0％、1.5％、2.0％(质量百分含量)的比例添加到石斑鱼饲料(市售的常规石斑鱼饲料)中，搅拌混匀制成4种颗粒状药饵。
64.用配制好的药饵投喂珍珠龙胆石斑鱼(在湛江市东海岛广东海洋大学高新科技园内进行石斑鱼养殖，试验组和对照组各设三个重复)，对照组投喂商品饲料，试验组分别投喂4种药铒饲料(分别标记为0.5组、1.0组、1.5组和2.0组)，按科学的饲养方法进行饲养管理。打氧机供氧，每两天换水1次。日投喂量为鱼体重的3
‑
5％，分两次投喂(上午9点，下午17点)，饲养期28天。
65.第28天将试验组和对照组的鱼分别称重、计数后，每组随机取15尾石斑鱼，尾静脉采血，然后在无菌条件下取出肠道。分别测定其血液中白细胞吞噬率、血清中超氧化物歧化酶活力、溶菌酶含量、抗菌活力等免疫指标和肠道菌群的数量。
66.29天后用1
×
107cells/ml的哈氏弧菌菌悬液攻毒，注射剂量为0.1ml/尾，观察并记录10天内各组石斑鱼的死亡情况，计算免疫保护率。
67.结果显示：
68.1)中草药免疫增强剂对石斑鱼生长的影响
69.中草药免疫增强剂对石斑鱼生长的影响如表1所示，4个试验组石斑鱼的增重率、成活率、饲料利用率均显著高于对照组，以1.5组的促生长效果最为显著。
70.表1中草药免疫增强剂对石斑鱼生长指标及性能指标的影响
[0071][0072]
增重率(％)＝(终末均重
‑
初始均重)
×
100/初始均重
[0073]
成活率(％)＝终末鱼尾数
×
100/初始鱼尾数
[0074]
饲料系数＝饲料消耗量/鱼总增重量
[0075]
2)中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道菌群的影响
[0076]
中草药免疫增强剂对石斑鱼肠道菌群的影响如图1
‑
图5所示，1.0组、1.5组和2.0组，石斑鱼肠道中细菌总数、乳酸菌数量和双歧杆菌数均显著高于对照组，而大肠杆菌和弧菌等致病菌的数量显著低于对照组，说明中草药免疫增强剂可以促进石斑鱼肠道中有益微生物(如乳酸菌、双歧杆菌)的增殖，通过争夺营养物质、竞争生存空间、分泌细菌素抑制有害微生物的生长等方式，改善石斑鱼的肠道菌群结构，从而提高石斑鱼的抗病能力。
[0077]
3)中草药免疫增强剂对石斑鱼免疫指标的影响
[0078]
中草药免疫增强剂对石斑鱼免疫指标如图6
‑
图9所示，1.0组、1.5组和2.0组，石斑鱼血液中白细胞的吞噬率显著高于对照组和0.5组，血清中溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、抗菌活力均显著高于对照组。1.5组的作用效果最为显著。
[0079]
4)中草药免疫增强剂对石斑鱼抗病力的影响
[0080]
中草药对石斑鱼抗病力的影响如图10所示，试验组石斑鱼的免疫保护率分别为：32.29％(0.5组)、54.79％(1.0组)、74.16％(1.5组)、67.71％(2.0组)，1.5组的抗病效果最佳。
[0081]
免疫保护率(％)＝(对照组死亡率
‑
实验组死亡率)
×
100/对照组死亡率
[0082]
结果表明：在基础饲料中添加1.5％的中草药免疫增强剂，试验组石斑鱼的增重率和成活率最高(分别比对照组高44.94％、8.33％)、饲料系数最低(比对照组低0.39)；石斑鱼血液中的白细胞吞噬率、血清中的超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活性、抗菌活力等免疫指标显著高于对照组，肠道中的双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的数量显著高于对照组，而大肠杆菌、弧菌等致病菌的数量显著低于对照组。石斑鱼经人工注射感染哈氏弧菌后，其免疫保护率为74.16％。
[0083]
试验例2
[0084]
将实施例1
‑
5和对比例1
‑
10的石斑鱼用中草药免疫增强剂按1.5％(质量百分含
量)的比例添加到石斑鱼饲料(市售的常规石斑鱼饲料)中，搅拌混匀制成颗粒状药饵。
[0085]
用配制好的药饵投喂珍珠龙胆石斑鱼(在湛江市东海岛广东海洋大学高新科技园内进行石斑鱼养殖)，分别标记为实施例1
‑
实施例5和对比例1
‑
对比例10组，按科学的饲养方法进行饲养管理。打氧机供氧，每两天换水1次。日投喂量为鱼体重的3
‑
5％，分两次投喂(上午9点，下午17点)，饲养期28天。
[0086]
第28天将各组的鱼分别称重、计数，29天后用1
×
107cells/ml的哈氏弧菌菌悬液攻毒，注射剂量为0.1ml/尾，观察并记录10天内各组石斑鱼的死亡情况，计算免疫保护率。
[0087]
表2实施例1
‑
5和对比例1
‑
10的中草药免疫增强剂对石斑鱼的各项指标的影响
[0088]
[0089][0090]
结果表明：本发明的石斑鱼用中草药免疫增强剂各原料间具有协同增效的作用，尤其是其中的熟地黄与茯苓、白术和石菖蒲，以及甘草与连翘。本发明通过中草药的合理配伍，并将其用于石斑鱼饲料中，石斑鱼的增重率、成活率、饲料系数和免疫保护率均优于对比例，其中增重率可达123.43％，成活率可达95％，饲料系数可为0.67，免疫保护率可达74.16％，大大提高了石斑鱼的成活率和抗病能力。
[0091]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种石斑鱼用中草药免疫增强剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：熟地黄5
‑
15份、绿豆10
‑
30份、葛根5
‑
20份、茯岺1
‑
10份、甘草1
‑
10份、郁金1
‑
10份、白术1
‑
10份、石菖蒲5
‑
15份、合欢花1
‑
10份、连翘1
‑
10份、蒲公英5
‑
20份、龙眼核5
‑
10份、木香1
‑
10份、山楂1
‑
15份。2.根据权利要求1所述的一种石斑鱼用中草药免疫增强剂，其特征在于，包括以下重量份的原料：熟地黄8
‑
10份、绿豆15
‑
20份、葛根10
‑
15份、茯岺5
‑
8份、甘草5
‑
7份、郁金4
‑
6份、白术4
‑
7份、石菖蒲6
‑
10份、合欢花5
‑
8份、连翘4
‑
6份、蒲公英8
‑
12份、龙眼核7
‑
9份、木香7
‑
9份、山楂8
‑
12份。3.一种如权利要求1或2所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将熟地黄、绿豆、葛根、茯岺、甘草、郁金、白术、石菖蒲、合欢花、连翘、蒲公英、龙眼核、木香和山楂14种中草药分别粉碎，并按比例混合均匀，得到所述石斑鱼用中草药免疫增强剂。4.根据权利要求3所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述粉碎的粒径要求为过100目筛。5.一种如权利要求1或2所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂作为饲料添加剂的应用。6.根据权利要求5所述的石斑鱼用中草药免疫增强剂作为饲料添加剂的应用，其特征在于，在石斑鱼饲料中添加所述中草药免疫增强剂，所述中草药免疫增强剂占石斑鱼饲料质量的0.5
‑
2％。