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植物抗虫基因工程的研究进展.docx

花匠小妙招
2024-11-02 09:41

本文格式为Word版，下载可任意编辑，页眉双击删除即可。第第 PGE * MERGEFORMT 1 页共 NUMPGES * MERGEFORMT 1 页植物抗虫基因工程的研究进展 1．2 Bt霉蛋白基因分类　　自1901年发觉XXXX金杆菌以来，现已分别出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及样子也不一样。依据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字I、II、III、IV等来命名，分别代表几种杀虫范围。在每一类型下依据氨基酸序列的同源性，又分为，B，C等不同的基因型。在同一基因型下依据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为，b，c等不同的基因亚型。其分类如下: cry I基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白，约30~140KD，在昆虫中肠内降解为60~70KD的多肽，在cry I基因间，氨基酸同源性为82%~90%的归为cry I ;55%~71%的归为cry I 基因中，依据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为:cry I ()，4.50kb;cry I (b)，5.30kb;cry I (c)，6.60kb亚类基因。Cry II基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白，约65KD。而cry II B只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达80%左右。cry III基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体，约72KD。Cry III 基因与cry I和cryIV基因的毒性核心5 端编码区有同源性，与3端编码区有所不同，假如将3端去掉，将失去杀虫活性。Cry IV基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭园形伴孢晶体。cry IV ，135KD;cry IV B，128KD;cry IV C，78KD;cry IV D，72KD，cry IV 和cry IV B基因在结构上与cry I相像，毒性核心区段为53~78KD，位于原毒素蛋白的N端。 1．3 Bt毒蛋白基因的修饰、改造及应用　　虽然早期的转抗虫基因植物或多或少都对昆虫有些抗性，但杀虫蛋白在植株上的表达量很低 (占全部可溶性蛋白的0.001%以下)，抗虫效果不理想。其主要缘由是目前使用的杀虫晶体蛋白大多来源于细菌，与高等植物结构基因正常的DN序列相比，Bt基因含有较多的T碱基和TTT重复序列。T富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子，TTT重复序列的mRN的稳定性差，二者都不能在高等植物中编码。此外，Bt基因中的偏爱密码子与植物中的不同，以及共中存在的一些不稳定元件如poly()信号序列、切割序列、终止序列等都直接影响着Bt基因在植物中的mRN特性。为此，Monsnto公司从两条途径对原基因进行了改造。第一条途径是改良Ti质粒转化载体的启动子，加入带有SV40复制增添子区的35S启动子或重复的强化表达区 (duplicted enhnced region)，发觉改建后的载体表达量比原先提高了5~10倍 (Perlk等，1990)。第二条途径是依据植物偏爱的密码子对野生型(WT)Bt基因cry I (b)进行部分改造或人工全合成，Perlk等对WT cryI(b)T富含区进行点突变，转变其中63个碱基对，T含量由63%下降至59%，而TTT重复序列也从13个削减至7个，部分改造后的基因称为PMcryI(b)。PMcryI(b)基因在转化的烟草和番茄中的表达量为1~l0ng/50ug植物可溶总蛋白，比WTcryI(b)在转基因植物中的表达量(1ng/50ug)提高了10倍。进一步在不转变编码的氨基酸序列的前提下，几乎更换掉WT基因中的全部不稳定元件，同时尽可能将其中的密码子换成植物优化密码子，T含量下降至51%，去掉全部TTT序列。全合成的基因称为Fncry I (b)用其转化烟草番茄，10%以上的转化植株表达量达30-100n/50ug植物可溶总蛋白，最高的可达100－150ng/50ug，比WtcryI(b)的表达量提高50－100倍，表现较强的杀虫效果。 2、蛋白酶抑制剂基因〔PI基因〕　　 PI是自然界最为丰富的蛋白质之一，存在于绝大多数生物体尤其是很多植物的贮XX器官，如种子和块茎中，是一类自然?的抗虫物质，与前述XXXX金杆菌相比，具有抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生耐受性等优点〔Gtehouse,1988〕。在植物界，现已发觉近10个蛋白酶抑制剂家族，与抗虫基因工程关系最紧密、讨论最深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，基中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。因为绝大多数昆虫所利用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含