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月季花瓣原生质体的提取和转化

花匠小妙招
2024-11-04 14:47

月季花瓣原生质体的提取和转化

本发明提供月季花瓣原生质体的提取和转化，属于细胞工程。

背景技术：

1、月季(rosa sp.)是蔷薇科蔷薇属多年生植物，俗称玫瑰。月季是全球重要的商品花卉，在切花、盆花、园林绿化、食用、精油和香料提取中应用广泛，销售额位居花卉前列。此外，月季是蔷薇科基础生物学研究，特别是花器官研究的模式植物，但是月季稳定遗传转化体系效率低，严重制约了月季功能基因组的研究。建立高效的月季原生质体制备和转化体系，对加快月季基因功能和信号转导研究以及育种技术开发有重要的意义。

2、植物原生质体，指植物细胞壁以内的特殊原生质部分，即用一定方法分解细胞壁后，得到的被质膜包裹的“裸露细胞”。原生质体容易吸收外界遗传物质，从而使其产生了广泛的应用价值—目前原生质体系统已被广泛应用于生理生化、遗传、分子生物学、基因组学、蛋白质组学及代谢组学的研究中，为细胞工程及生物技术的发展提供了广阔的前景。目前已有拟南芥、水稻等模式植物的原生质体转化体系，但是在月季花瓣上尚未建立高效的原生质体制备和遗传转化体系。

3、目前国内对于月季原生质体分离的专门研究尚不充分，相关资料较少。并且，月季原生质体分离使用的原材料几乎全部来自叶片，少部分使用胚性细胞悬浮物(胡超.月季原生质体分离条件的研究.张春爱.丰花月季愈伤组织诱导与原生质体培养的研究)。国外方面，1973年，pearce和cocking首次从月季悬浮培养细胞中分离得到原生质体(pearce r s,cocking e c.behaviour in culture of isolated protoplasts from"paul's scarlet"rose suspension culture cells[j].protoplasma,1973,77(2):165-180.)，1997年，marchant等人从月季叶片中分离获得原生质体(marchant r,davey m r,power jb.isolation and culture of mesophyll protoplasts from rosa hybrida[j].plantcell tissue&organ culture,1997,50(2):131-134.)。在此基础上，近几年对于月季原生质体分离与纯化技术都有一定的研究，但其所用材料多集中于愈伤组织或叶片，对于直接取材于花瓣的研究较少，所以月季花瓣瞬时表达体系的建立对于在月季本体中研究基因功能是至关重要的。

技术实现思路

1、为了解决上述现有技术中的一个或多个技术问题，本发明在第一方面提供了一种用于从花瓣中提取原生质体的酶解用溶液，所述酶解用溶液包含纤维素酶、离析酶、kcl、mes(即2-吗啉乙磺酸)、cacl2、甘露醇和bsa(牛血清白蛋白)。

2、本发明在第二方面提供了一种用于从花瓣中提取原生质体的提取试剂盒，所述提取试剂盒包括：

3、(1)用于配制本发明第一方面所述的酶解用溶液的试剂；

4、(2)用于配制w5溶液的试剂，其中，所述w5溶液包含2mmol/l mes、154mmol/lnacl、125mmol/l cacl2和5mmol/l kcl；优选的是，所述w5溶液的ph为5.7。

5、本发明在第三方面提供了一种从花瓣中提取原生质体的方法，所述方法采用本发明第二方面所述的提取试剂盒进行。

6、本发明在第四方面提供了一种用于花瓣原生质体的转化试剂盒，所述转化试剂盒包括：

7、(1)用于配制权利要求本发明第一方面所述的酶解用溶液的试剂；

8、(2)用于配制w5溶液的试剂，其中，所述w5溶液包含2mmol/l mes、154mmol/lnacl、125mmol/l cacl2和5mmol/l kcl。优选的是，所述w5溶液的ph为5.7；

9、(3)用于配制mmg溶液的试剂，其中，所述mmg溶液包含4mmol/lmes、0.5mol/l甘露醇、15mmol/l mgcl2；和

10、(4)用于配制peg-ca溶液的试剂，其中，所述peg-ca溶液包含40％peg 4000、0.25mol/l甘露醇和50mmol/l cacl2。

11、本发明在第五方面提供了一种用于花瓣原生质体的转化方法，所述方法采用本发明第四方面所述的转化试剂盒进行。

12、本发明在第六方面还提供了一种花瓣原生质体的提取和转化的方法，所述方法包括如下步骤：

13、(1)选择健壮无病虫害的植株例如月季植株；

14、(2)从所述植株的完全开放的花朵上获取花瓣，用刀片将所述花瓣切成宽0.5-1mm均匀细条，浸泡在酶解用溶液中；

15、(3)在黑暗和真空条件下让所述酶解用溶液渗透到花瓣细条中，然后在黑暗条件下在25rpm至35rpm的速度下在摇床上摇晃酶解5h，得到含有花瓣原生质体的酶解液；

16、(4)步骤(3)中所得的酶解液用w5溶液(w5溶液的体积用量为所述酶解液的1至1.5倍)稀释，然后用细胞筛(例如70微米孔径)过滤，所得的滤液经过低速离心(离心速度为100g至150g)，弃上清，用w5溶液(w5溶液的体积用量为所述酶解液的0.5至1倍)重悬原生质体沉淀，低速离心(离心力为100g至150g)，弃上清，然后用1ml的w5溶液重悬原生质体沉淀(至此实现花瓣原生质体的提取)，再于冰上静置30分钟；

17、(5)将完成静置的溶液低速离心(离心速度为100g至150g)，弃上清，使用mmg溶液(mmg溶液的体积用量为步骤(3)所得的酶解液的0.75至1倍)重悬原生质体沉淀，得到花瓣原生质体悬浮液，然后将其放在冰上待用；

18、(6)在所述花瓣原生质体悬浮液中添加质粒、40％ peg-ca溶液，颠倒混匀，静置5分钟(即室温温浴5分钟)；其中每100μl的原生质体悬浮液中加入5-10μg(例如5、6、7、8、9或10μl)的质粒和110μl peg-ca溶液。

19、(7)加入w5溶液，颠倒混匀，低温低速离心，弃上清，加入w5溶液重悬原生质体沉淀，转移到12孔培养板中避光静置培养，完成月季花瓣原生质体的转化。

20、本发明通过上述第一方面至第六方面所述的技术方案的目的主要是实现从花瓣例如月季花瓣的原生质体的简单且高效的提取和转化。

21、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

22、本发明通过对月季花瓣原生质体的提取以及转化，利用纤维素酶、离析酶、甘露醇等的组合分离纯化月季的原生质体，有效克服了月季原生质体分离效率低的问题，仅需5小时左右即可获得大量完整的原生质体，建立了月季原生质体制备体系，并保证原生质体活力在80％以上。在此基础上，进行了原生质体的转化，转化效率达到71.7％左右，对月季基因功能的研究和遗传性状的改良具有重要意义。

23、本发明以月季‘萨曼莎’的花瓣为材料，分离纯化原生质体，建立高效稳定的原生质体提取以及瞬时表达体系，旨在为月季基因功能研究、改良遗传性状、分子育种等研究领域提供技术支持。