首页 > 分享 > 植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用.pdf

植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用.pdf

花匠小妙招
2024-11-04 23:12

《植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101914147 B (45)授权公告日 2013.01.16 CN 101914147 B *CN101914147B* (21)申请号 201010259901.4 (22)申请日 2010.08.20 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人中国农业科学院作物科学研究所地址。

2、 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号作物科学研究所 (72)发明人张增艳李钊辛志勇徐惠君杜丽璞周淼平 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅任凤华 US 2007044171 A1,2007.02.22, 全文 . CN 1740190 A,2006.03.01, 全文 . CN 1687416 A,2005.10.26, 全文 . 李钊 . 抗纹枯病基因的克隆及转基因小麦的研究 .中国优秀硕士学位论文全文数据库 .2011,( 第 9 期 ), 全文 . Molina,A. 等 .CAA91435.1.Genbank .。

3、2005, 全序列 . (54) 发明名称植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用 (57) 摘要本发明公开了一种植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且与植物抗病相关的由序列 1 衍生的蛋白质。将本发明蛋白的编码基因导入植物，可以得到抗病能力显著增强的转基因植物。本发明对于培育抗病植物，特别是抗纹枯病、赤霉病菌植物具有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员。

4、韦炜权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 2 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 7 页序列表 2 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种蛋白质，是由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因，其特征在于：所述基因是如下 1) 或 2) 的 DNA 分子： 1) 序列表中序列 2 自 5 端第 58 至 405 位核苷酸所示的 DNA 分子； 2) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子。 4. 含有权利要求 2 或。

5、3 所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。 5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求2 或 3 所述基因插入载体 pAHC25 的多克隆位点得到的重组质粒。 6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗病能力高于所述目的植物的转基因植物；所述植物为小麦；所述抗病为抗纹枯病和 / 或抗赤霉病。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或 5 所述重组表达载体导入所述目的植物中。 8. 如权利要求 6 或 7 所述的方法，其特征在于：所述纹枯病是由禾谷丝核菌。

6、 (Rhizoctonia cerealis) 引起的；所述禾谷丝核菌具体为禾谷丝核菌 R0301 ；所述赤霉病是由禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum) 引起的；所述禾谷镰刀菌具体为禾谷镰刀菌 F15。 9. 权利要求 2 或 3 所述基因、权利要求 4 或 5 所述重组表达载体或权利要求 6 至 8 中任一所述方法在培育抗病植物中的应用；所述植物为小麦；所述抗病为抗纹枯病和 / 或抗赤霉病。权利要求书 CN 101914147 B 2 1/7 页 3 植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用技术领域 0001 本发明涉及一种植物抗病相关蛋白及。

7、其编码基因和应用。背景技术 0002 脂质转移蛋白 (lipid transfer proteins， LTPs) 是植物生命活动中一类重要的活性蛋白质，是可以结合脂质的富含半胱氨基酸的碱性、小分子蛋白， LTPs 是一种分泌型蛋白，定位于细胞壁。脂质转移蛋白参与膜的生物合成和胞内脂肪酸库的调控以及植物防御反应，为病程相关蛋白 (pathogenesis-related proteins， PR)PR14 家族的成员 (Kirubakaran S.Isaac， Begum S.Mubarak， Ulaganathan K.， Sakthivel N.2008， Charac。

8、terization of a new antifungal lipid transfer protein from wheat， Plant Physiology and Biochemistry 46 ： 918-927)。研究证明，一些 LTPs 在体外可以抑制一些真菌病原菌的生长，并具有协同增强防御素与硫瑾等其他抗菌肽对微生物抗性的能力 (Marion D.， Douliez J.P.， .Gautier M.F， .Elmorjani K， Plant lipid transfer proteins ： relationships between allergenicity 。

9、and structural， biological and technological properties， in ： E.N.C.Mills， P.R.Shewry(Eds.)， Plant Food Allergens， Blackwell Science， Oxford， 2004， pp.57-69)。不同的 LTPs 对病原微生物的抑制活性不同。 0003 赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的小麦和大麦重要病害，遍及全国，一直是淮河以南及长江中下游麦区发生最严重的病害之一，在大流行年份，产量损失可达 10 -40。由于赤霉病菌分泌在穗部子粒间、子粒中的毒素，不仅对植物有害。

10、，还对人、畜有毒，因此小麦和大麦一旦发生赤霉病，收获的其子粒就不可使用。近年，小麦土传病害特别纹枯病在我国小麦生产区危害日益严重。小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG4， AG5融合群引起的土传真菌病害。纹枯病一般可使小麦减产 10 -20，严重地块减产 50以上。据江苏省植保站统计， 1995年全省小麦因纹枯病造成的损失达3.72106吨，超过江苏省当年小麦赤霉病和白粉病引起损失之和。据全国农技推广中心报。

11、道， 2004 年我国有 1.2 亿亩遭受纹枯病的危害， 2005年小麦纹枯病发生面积达1亿亩。另外，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) 还可引起水稻、玉米纹枯病，造成着 2 种作物严重减产。近年来，赤霉病和纹枯病已对我国粮食安全构成严重威胁，成为我国粮食生产中亟待解决的重要问题。由于赤霉病和土传病害难以预测和预防，培育和利用抗病品种是防治这些病害的最经济有效的措施之一。然而，赤霉病和纹枯病抗性是由多个基因控制的数量性状，作物种属内抗源匮乏，常规育种进展缓慢。抗病有效基因的发掘与克隆，以及应用基因工程创造抗病新种质，为解决上述问题开辟了一条。

12、新途径。发明内容 0004 本发明的目的是提供一种植物抗病相关蛋白及其编码基因和应用。说明书 CN 101914147 B 3 2/7 页 4 0005 本发明提供的蛋白质，来源于小麦属小麦 (Triticum aestivum Linn.)，是如下 (a) 或 (b) ： 0006 (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 0007 (b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且与植物抗病性相关的由序列 1 衍生的蛋白质。 0008 为了使 (a) 中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组。

13、成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0009 表 1 标签的序列 0010 标签残基序列 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0011 上述 (b) 中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述 (b) 中的蛋白质 1 的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和 / 或进行一。

14、个或几个碱基对的错义突变，和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0012 编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。 0013 所述基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的 DNA 分子： 0014 1) 序列表中序列 2 自 5 端第 58 至 405 位核苷酸所示的 DNA 分子； 0015 2) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子； 0016 3)在高严谨条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码抗病相关蛋白的DNA分子； 0017 4) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性且编码抗病相关蛋白的。

15、DNA 分子。 0018 所述高严谨条件为在 2SSPE( 或 2SSC)， 0.1 SDS 的溶液中，在 68下杂交并洗膜。 0019 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。 0020 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的 3 端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3 端。使用所述基因构说明书 CN 1019。

16、14147 B 4 3/7 页 5 建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工。

17、，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在 pAHC25 载体的多克隆位点插入所述基因得到的重组质粒。 0021 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗病能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接 DNA 转化、显微注射、电导、农杆菌。

18、介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦 ( 如小麦品种扬麦 18)、大麦、玉米或水稻。所述抗病可为抗纹枯病和/或抗赤霉病。所述纹枯病具体可为由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis) 引起的纹枯病，如禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis)R0301 引起的纹枯病。所述赤霉病具体可为由禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum) 引起的赤霉病，如禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)F15 引起的赤霉。

19、病。 0022 所述基因、所述重组表达载体或所述方法均可用于培育抗病植物。育种时，可以将所述基因导入小麦，筛选可表达所述基因的转基因植株，并进行接种、抗病鉴定，得到抗病小麦。 0023 本发明克隆出小麦TaBS108基因的全长编码cDNA序列，构建了该基因的单子叶表达载体，利用基因枪将该基因载体导入小麦，并对 T0、 T1 代转基因植株进行分子检测和对 T1 代分子检测阳性植株接种纹枯病致病菌进行抗病鉴定，得到了抗纹枯病 (IT 1) 的 T1 代转基因小麦和赤霉病抗性提高的 T1 转基因代小麦植株。本发明对于抗病植物的育种具有重要意义。附图说明 0024 图。

20、1 为从小麦 cDNA 中 PCR 扩增 TaBS108 基因 (WBS108) 序列的电泳图；泳道 1 和 2 为 PCR 扩增产物 (TaBS108) ； M 为 DNA 分子量 100bp 标准 ( 购自大连宝生物公司 ) ；箭头指的条带大小为 538bp。 0025 图 2 为重组质粒 pA25-WBS108 的结构示意图。 0026 图 3 为部分再生植株的 PCR 鉴定结果。 0027 图 4 为接种禾谷丝核菌 R0301 后转 TaBS108 基因植株和扬麦 18 的表型。 0028 图 5 为部分转 TaBS108 基因植株的 RT-PCR 检测图谱。具体实施方式说。

21、明书 CN 101914147 B 5 4/7 页 6 0029 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T0代表示由基因枪得到的转基因植株， T1代表示 T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。 0030 小麦品种苏麦 3 号：购自江苏省农业科学院 ( 江苏太湖地区农业科学研究所于 1974 年通过 Funo/ 台湾小麦杂交育成的抗赤霉病小麦品种 )。小麦品种扬麦。

22、 18 ：购自江苏里下河地区农业科学研究所。小麦纹枯病致病菌 - 禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis) R0301 ：购自江苏省农业科学院。小麦赤霉病致病菌-禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum) F15 ：购自江苏省农业科学院。 0031 单子叶植物表达载体pAHC25(pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、 Exon、 Intron、 GUS、 Nos终止子， GUS两端具有SmaI和SacI 酶切位点，第 2 个表达盒具有玉米 Ubiquitin 启动子、 Exon、 Intro。

23、n、 Bar、 Nos 终止子 ) ：公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献： Christensen and Quail， 1996 ； Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/ or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research， 5， 213-218。 0032 实施例 1、 TaBS108 蛋白及其全长 cDNA 序列的发现 0033 一、 TaBS108。

24、蛋白及其全长 cDNA 序列的发现 0034 1、将生长四周的小麦品种苏麦 3 号幼苗的叶片接种赤霉病菌； 0035 2、 48 小时后，用 TRIZOL 的方法提取叶片的总 RNA，按照大连宝生物公司提供的方法合成 cDNA 第 1 条链，并以其作为 PCR 扩增、克隆 TaBS108 的模板； 0036 3、设计的一对 PCR 扩增引物 (WBS108-U 和 WBS108-L)。 0037 WBS108-U ： 5 -CCCATCTCACCATCTCCA-3 ； 0038 WBS108-L ： 5 -TCCTCTCGCTGTCACGCA-3 。 0039 4、以步骤。

25、 2 的 cDNA 为模板，用步骤 3 的引物对进行 PCR 扩增，得到扩增产物。 0040 PCR 反应总体积为 25L，包括 2L cDNA(50ng)， 100mol/L dNTP， 0.4mol/L 每条引物， 1U LA-Taq 酶及 2GC PCR 缓冲液 ( 均购自大连宝生物公司 )。 0041 PCR 反应程序为： 95预变性 3min ；然后 94 35s， 56 30s， 72 45s， 5 个循环；再进入 94 35s， 54 30s， 72 45s， 30 个循环；最后 72， 8min 补平末端。 0042 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图 1。。

26、结果表明，从接种赤霉病菌的苏麦 3 号叶片 cDNA 中扩增出一条约 538bp 的带。 0043 5、将 538bp 的带回收，克隆到 pMD18-T 载体上，经过菌落 PCR 分析后，挑选 5 个阳性克隆进行测序分析。测序分析结果表明，该 DNA 片段具有序列表中序列 2 的全长 ORF 的核苷酸序列，编码序列表的序列 1 所示的蛋白质。 0044 二、序列分析 0045 将序列表的序列 1 所示蛋白质命名为 TaBS108 蛋白，由 115 个氨基酸残基组成。将 TaBS108 蛋白在 NCBI 进行 GenBank 的 BLASTP 比较和结构域分析。结果表。

27、明， TaBS108 蛋白具有 nsLTP1 典型结构域，是 1 个典型的 nsLTP， TaBS108 蛋白的氨基酸序列与大麦的说明书 CN 101914147 B 6 5/7 页 7 LTP(Q42842)氨基酸序列具有91一致性，与小麦的LTP1(ABF14725)氨基酸序列具有88 一致性。 0046 将 TaBS108 蛋白的编码基因命名为 TaBS108 基因，其开放阅读框为自序列表中序列 2 的 5末端的第 58 位至第 405 位核苷酸。 0047 实施例 2、转 TaBS108 基因小麦植株的获得及其抗病性分析 0048 一、重组表达载体的构建 0049 1。

28、、提取苏麦 3 号幼苗叶片的 RNA，反转录为 cDNA ； 0050 2、以步骤1的cDNA为模板，用WBSO-SMF和WBSO-SAR组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR 扩增产物 ( 携带 SmaI 和 SacI 位点的 TaBS108 基因全长 ORF)。 0051 WBSO-SMF ： 5 -AT CCCGGG ATGGCTCGCGGTGCAGCTA-3 ( 下划线标注 SmaI 酶识别位点 ) ； 0052 WBSO-SAR ： 5 -TT GAGC TCAACGAATCTTAGAACAGTCCA-3 ( 下划线标注 SacI 酶识别位点 )。 0053 PCR 。

29、反应程序：先 95预变性 3min ；然后 95 30s， 60 1min， 72 1min， 35 个循环；最后 72 10min 补平末端。 0054 3、回收 PCR 扩增产物，与 pMD18-T 载体 ( 大连宝生物公司 ) 连接，得到重组载体 pTWBS108。 0055 4、用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 酶切重组载体 pTWBS108，回收约 370bp 的片段。 0056 5、用限制性内切酶SmaI和SacI酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架。 0057 6、将步骤 4 回收的片段和步骤 5 回收的载体骨架连接，得到连接产物。。

30、 0058 7、将连接产物进行测序，测序结果表明得到了重组质粒 pA25-WBS108。 0059 重组质粒 pA25-WBS108 的结构示意图如图 2 所示：骨架载体为 pAHC25，在 SmaI 和 SacI 酶切位点之间插入了序列表中序列 2 的 5末端的第 58 位至第 405 位核苷酸所示的 TaBS108 基因； TaBS108 基因受 Ubiquitin 启动子控制；质粒还具有 1 个受 Ubiquitin 启动子控制的 Bar 基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦 (Bialaphos) 筛选转化再生植株提供抗性标记。 0060 二、转基因植物。

31、的获得 0061 1、将 1000 块扬麦 18 的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒 pA25-WBS108 轰击到愈伤组织。 0062 2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理 16h。 0063 3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB1 1mg/L，天冬门酰胺 150mg/L， 2， 4-D 2mg/L) 上，恢复培养 2 周 (26，暗培养 )。 0064 4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中 (1/2 MS 培养基 +NAA1mg/ L+KT 1mg/L+Bialaphos2-5mg/L)，。

32、24-26光照培养 14d ；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中 (1/2 MS 培养基 +Bialaphos 2-3mg/L)， 24-26光照培养；获得了 110 株再生植株。 0065 5、将再生植株转移到壮苗培养基 (1/2MS 培养基 +0.5mg/L NAA) 上，将苗高 7-8cm 且根系发达的转化苗移栽到花盆，在移栽到温室 3 周以后，有 105 株植株成活。 0066 6、分子鉴定说明书 CN 101914147 B 7 6/7 页 8 0067 在 4 叶期，每株成活的再生植株取 1 个叶片提取基因组 DNA，将基因组 DNA 作为模。

33、板，利用 TaBS108 基因特异的一段序列作为上游引物 (WBST-U)，载体 TNOS 序列特异的一段序列作为下游引物 (TNOS-L) 进行 PCR。 0068 WBST-U ： 5 -ATATCCTGCGGTCAGGTGAC-3 ； 0069 TNOS-L ： 5 -ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3 。 0070 PCR 扩增体系 (20ul) ： 2GC Buffer 10ul， WBST-U(10um)0.5-1ul， TNOS-L(10um)0.5-1ul，基因组 DNA 1ul， r-Taq(5U/ul)0.2ul， dNTP(2.5mM)1.5ul，。

34、 H2O 补至 20ul。 0071 PCR 扩增程序： 94 3min ； 35(94 45s， 58 45s， 72 45s) ； 72 8min。 0072 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳， EB 染色，紫外拍照。 0073 扩增得到 458bp 条带 (TaBS108-TNOS 基因片段 ) 的植物为转基因植物。部分植株的 PCR 检测结果如图 3 所示。图 3 中， M 为 100bp 分子量标准，泳道 - 为 ddH2O，泳道 WT 为扬麦 18，泳道 1、 2、 4、 6、 8、 12 为 PCR 阳性植株，泳道 3、 5、 7、 9、 10、 11 为。

35、PCR 阴性植株，泳道 + 为质粒 pA25-WBS108( 阳性对照 )。获得转 TaBS108 基因 T0代 PCR 阳性植株 13 株，转化率为 1.30。 0074 三、转空载体植物的获得 0075 用载体 pAHC25 代替重组质粒 pA25-WBS108，其它同步骤二，得到转空载体植株，作为转基因植株的对照。 0076 四、转基因植物的纹枯病菌抗性鉴定 0077 在网室田间种植如下小麦材料：转 TaBS108 基因 T1代植株 189 株 (10 株行，每行 18-20 株 )，转空载体 T1代植株 (1 株行， 20 株 ) 和野生型扬麦 18(2 株行。

36、，每行 20 株 ) ；拔节期 ( 约 8 周后 )，采用蔡士宾等的牙签培养法蔡士宾，任丽娟，颜伟，吴纪中，陈怀谷，吴小有，张仙义 .2006， Germplasm development and mapping of resistance to sharp eyespot(Rhizoctonia cerealis)in wheat.中国农业科学， 39(5) ： 928-934接种禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis)R0301 的菌丝到小麦叶鞘部，浇水保湿 5-7 天，隔一周喷水 2-3 次。 0078 在收获时拍照并考察叶鞘和茎秆的发病情况。。

37、病情分级标准按照李斯深等方法进行 ( 李斯深，李安飞，李宪彬等 .1997，小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报 . 作物品种资源 .(4) ： 31-33) ： IT 0 ：无病； 1 级：第 1、 2 叶鞘发病，但茎秆无病； 2 级：第 1、 2 叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于 1/3 ； 3 级：第 3、 4 叶鞘发病，或病斑绕茎秆 1/3-2/3 ； 4 级：第 5、 6 叶鞘发病，或病斑绕茎秆 2/3-1 周； 5 级：出现枯、白穗或整株枯死。 0079 转TaBS108基因T1代189株植株中， 126株(66.7)转TaBS108基因植株IT。

38、1，转空载体植株的平均 IT 为 2.69，扬麦 18 的平均 IT 为 2.68。对纹枯病抗病性鉴定结果表明，大多数转 TaBS108 基因植株对纹枯病抗性强于转空载体植株和扬麦 18。其中一株抗纹枯病小麦植株 TB3(IT 为 0) 和扬麦 18(IT 为 4) 的照片见图 4。 0080 五、转基因植物中 TaBS108 基因表达量的检测 (RT-PCR) 0081 1、步骤四中进行病情评级时，取各个株系的叶片，提取 RNA，反转录为 cDNA。 0082 2、以步骤 1 的 cDNA 为模板，然后以 TaBS108 基因特异引物 (WBS-QF 和 WBS-QR。

39、) 进行 PCR 反应分析转基因表达量；用组成性表达的 18S rRNA 基因 (18SrRNA ： F ：说明书 CN 101914147 B 8 7/7 页 9 5 -GTGACGGGTGACGGAGAATT-3 ， R ： 5 -GACACTAATGCGCCCGGTAT-3 ) 作为内参，调整扩增模板 mRNA/cDNA 的起始浓度一致 ( 即均一化 )。 0083 WBS-QF ： 5 -GGCGATATCCTGCGGTCA-3 ； 0084 WBS-QR ： 5 -GCACGCTGCTTGCTTGTCA-3 。 0085 部分 RT-P。

40、CR 结果见图 5。图 5 中， WT 代表样本为野生型扬麦 18 的单株， TB1-TB9 分别代表样本为 TB1-TB9 的单株，各个泳道上的 IT 即该单株的 IT 值。扩增得到 151bp 为 TaBS108 基因表达量较高的转基因阳性植株。与抗病性关系比较发现， TaBS108 表达量越高的转基因阳性植株对纹枯病抗性就最强，说明 TaBS108 超量表达增强了转基因小麦对纹枯病的抗性。 0086 六、转基因植物的赤霉病菌抗性鉴定 0087 转 TaBS108 基因 T1代植株 22 株；种植于江苏生物技术研究所网室田间，于开花期注射接种禾谷镰刀菌(Fusarium 。

41、graminearum)F15分生孢子液(500孢子/10L)到小麦中心穗部，保湿3-5天，并于接种21天统计病小穗率。采用周淼平等的方法评价病小穗(Zhou M.P.， Hayden M.J.， Zhang Z.Y.， Lu W.Z.and Ma H.X.2010.Saturation and mapping of a major Fusarium head blight resistance QTL on chromosome 3BSof Sumai 3 wheat. J Appl Genet.51 ： 19-25)。 0088 转空载体植株的病小穗率平均值为 17.3，野生型扬。

42、麦 18 的病小穗率平均值为 16.6， 22 株转 TaBS108 基因植株中，筛选到赤霉病抗性提高的转基因植株 8 株 ( 见表 2，病小穗率为 7.5-12.7 )，表明转 TaBS108 基因小麦对赤霉病抗性得到提高。 0089 表 2 赤霉病抗性提高的转基因小麦植株 0090 植株编号赤霉病病小穗率 ( ) TB2-4 11.9 TB3-1 12.7 TB4-5 10.2 TB5-3 7.5 TB6-6 8.2 TB7-2 12.5 TB8-6 8.0 TB12-1 9.0 说明书 CN 101914147 B 9 1/2 页 10 0001 0002 序列表 CN 101914147 B 10 2/2 页 11 序列表 CN 101914147 B 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说明书附图 CN 101914147 B 12 2/2 页 13 图 4 图 5 说明书附图 CN 101914147 B 13 。