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病毒发现史（第一集）烟草花叶病毒的曲折发现史，多人错失诺奖

花匠小妙招
2024-11-05 02:46

读病毒发现史，品人生百态。

人类历史上最早关于病毒的记载可以追溯到公元前3700年，当时古埃及象形文字上记录了一位牧师因小儿麻痹症瘫痪（就是后来人们知道的脊髓灰质炎病毒感染）。后来古希腊时代记录了狂犬病，公元前5世纪记录了天花，后来又陆续记录了流感、腮腺炎和黄热病等。人类历史上首次关于疫苗的应用当然要数北宋年间（大约公元10世纪）我国用人工接种预防天花，这是不争的事实。到公元11世纪，接种天花在中国和印度就已经很普遍了。然而这一技术直到公元17世纪才通过丝绸之路传到欧洲。1798年，英国医生Edward Jenner才发明了种牛痘来预防天花的方法，并且一直沿用至今。尽管1885年法国科学家Louis Pasteur（路易斯巴斯德）制备了人类历史上第一个狂犬病毒疫苗。但是，人类发现的第一个病毒却是烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）。烟草花叶病毒的发现史是曲折的，在这过程中多人错失诺奖，非常可惜。

回顾烟草花叶病毒（TMV）的研究历史有很多，首先是它是第一个被发现的病毒，因此标志着病毒学领域的开始。然而，并不是每个新发现的物种一开始都是一个经过充分研究的对象。随着病毒学在二十世纪初的兴起，烟草花叶病毒确实成为研究最充分的病毒之一，并一直处于该领域的最前沿。它被用来阐明有关病毒性质的基本知识，并作为生物医学和农业的模型。尽管动物病毒很快被鉴定出来，但第一个被鉴定出来的病毒来自植物，这一事实意味着病毒学从一开始就具有高度的可比性。在十九世纪末，疾病的细菌理论改变医学后不久，科学家们开始对一类不符合科赫假设的新型传染性病原体感到困惑。这些观察结果首先出现在利润丰厚的作物烟草中，烟草是一种南美植物，通过西班牙与新世界土著人的贸易网络进入旧世界，然后在整个欧洲被驯化。1876年，德国农业化学家、荷兰瓦赫宁根农业实验站主任阿道夫·梅耶尔（Adolf Mayer）开始研究一种影响烟草的斑点病。他将其命名为烟草花叶病，并表明从患病植物的叶子中提取的汁液可用于感染健康植物。这种实验传播表明存在细菌或真菌，但对这些提取物的反复显微镜检查没有发现生物体，梅耶尔也无法在实验室中培养病原体。遗憾的是，由于当时细菌研究盛行，梅耶尔毫不怀疑地认为烟草花叶病是细菌引起的。

感染烟草花叶病毒的植株（Angela N H Creager. 2022. Annu Rev Virol）

Adolf Mayer（阿道夫·梅耶尔）（图片来源于Turkcewiki.org）

俄罗斯的德米特里·伊万诺夫斯基（Dmitri Ivanovskii）跟进了梅耶尔的调查。1892 年，他报告说，患烟草花叶病的植物的汁液在通过细菌过滤器后仍然具有传染性。荷兰微生物学家Martinus Willem Beijerinck（贝耶林克）独立地进行了相同的观察。与伊万诺夫斯基不同，贝耶林克声称烟草花叶病的病原体不是一种微小的细菌，而是某种根本不同的东西：它是一种传染性液体或传染性颗粒。这引发了长达25年的关于什么是病毒的争论：液体还是颗粒。

病毒学之父-Dmitri Ivanovskii（德米特里·伊万诺夫斯基）（图片来源于MooseJawToday.com）

Martinus Willem Beijerinck（贝耶林克）（图片来源于Wikipedia）

在这三位首先研究烟草花叶的微生物学家中，只有Beijerinck在他的论文中使用了更古老并且通用的术语“virus”。他将其与这种新型亚微观病原体联系起来。1898 年，科学家们还发现两种动物病原体，即口蹄疫和兔粘液瘤病原也能通过细菌过滤器。随后，导致非洲马瘟、禽瘟和黄热病的病原体也很快进入了可过滤的病毒名单。这些病毒在很大程度上被定义为负面的，无法通过细菌过滤器去除，无法在显微镜下看到或无法在无细胞培养中生长的传染性病原体。1900年，John M'Fadyean宣布病毒是强制性的寄生虫。到1920年，这才被认为是病毒的核心特征，尽管有人继续尝试在无细胞培养基中培养这些能够通过过滤器的病原体。尽管细菌学的工具在定义病毒特征上起了很重要的作用，但对证明并且分离病毒几乎没有帮助。

尽管许多被记录的病毒来自动物或人类，但烟草花叶病毒仍然特别适合实验室研究，因为它具有高度传播性，并且在过滤的汁液中具有较长的保质期。植物科学家对烟草花叶病毒的感染性、遗传学、免疫化学和宿主耐药性方面展开了富有成效的研究。博伊斯·汤普森植物研究所（Boyce Thompson Institute for Plant Research）于1924年成立，迅速成为美国烟草花叶病毒研究工作的中心。在那里，路易斯·昆克尔（Louis Kunkel）领导了一个花叶病研究小组，其中包括弗朗西斯·霍姆斯（Francis Holmes），他开发了一种定量方法来确定烟草花叶病毒的感染性，即局部病变测定（the local lesion assay）。海伦·珀迪（Helen Purdy）提出了针对烟草花叶病毒的兔抗体，并证明它们可以中和感染。昆克尔小组的另一位研究人员卡尔·文森（Carl Vinson）试图使用醋酸铅化学分离烟草花叶病毒，但无法获得纯制剂。

1932年，昆克尔搬到洛克菲勒医学研究所，担任普林斯顿新成立的植物病理学系主任。他带来了一些员工，但聘请了一位比文森更好的化学家，温德尔·斯坦利（Wendell M. Stanley）。同样位于洛克菲勒研究所普林斯顿分院的化学家-约翰诺斯罗普（John Northrop）（斯坦利和诺斯罗普两人后来都获诺奖了）正在从胃蛋白酶开始结晶消化酶。Stanley用诺斯罗普纯化的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理烟草花叶病毒感染的叶子提取物，病毒感染性的降低强烈地表明植物病毒是一种蛋白质。于是他利用诺斯罗普的硫酸铵沉淀方法，结合福尔摩斯的局部病变测定法来纯化病毒。1935年，斯坦利在《科学》杂志上发表了一篇论文，宣布他已经获得了烟草花叶病毒的蛋白质晶体。他的论文被《纽约时报》的头版报道，标题为“在普林斯顿分离出的晶体被认为是看不见的疾病病毒”。

Stanley（斯坦利）获得的烟草花叶病毒结晶（Angela N H Creager. 2022. Annu Rev Virol）

Wendell M. Stanley（斯坦利）（图片来源于www.nndb.com）

John Northrop（约翰诺斯罗普）（图片来源于NAE Website）

英国的弗雷德里克·鲍登（Frederick C. Bawden）和诺曼·皮里（Norman W. Pirie）重复了斯坦利的实验，并且挑战了他的主张）。他们声称发现烟草花叶病毒含有核酸（RNA）和蛋白质，其针状沉淀物不是真正的晶体。然而，他们也同样证实了他的化学方法的价值。Stanley 随后的研究获得了有关烟草花叶病毒和其他植物病毒物理特性的大量信息。斯坦利在他 1935年的论文中提出病毒可能像食盐一样简单，其影响超出了他的具体发现。赫尔曼·穆勒（Hermann J. Muller）将斯坦利分离出的病毒称为“某种基因”。马克斯·德尔布吕克（Max Delbrück）受到烟草花叶病毒结晶的启发，将病毒视为解开“生命之谜”的关键。Delbrück认为目前烟草花叶病毒研究过于以化学为导向，不符合他的的口味，但他在噬菌体中发现了一种适合对病毒遗传学进行定量分析的系统。斯坦利最出名的是他对烟草花叶病毒的结晶，但1930年代与拉尔夫·威科夫（Ralph Wyckoff）的一次偶然发现对病毒研究产生了更大的重大影响。洛克菲勒研究所（Rockefeller Institute）的生物物理学家威科夫（Wyckoff）在超速离心机中分析斯坦利烟草花叶病毒的样本时观察到，当他以25,000转/分的速度离心来自花叶病烟草植物的透明汁液时，一团纤维物质沉淀到管子底部。当在显微镜下分析时，这种颗粒被看到由针状晶体组成。Wyckoff和他的同事Robert Corey很快发表了证据，证明这些离心机产生的晶体与Stanley通过化学方法制备的晶体材料没有区别。因此，这一发现被《纽约时报》的一位作家称为“科学的新旋风”。超速离心机不仅可以用于分析病毒，还可以用于制备纯净的病毒，这是研究许多病毒的重大发现，因为这些病毒太脆弱而无法进行化学提取。Wyckoff和合作者使用超速离心机分离出了马铃薯X病毒、烟草环斑病毒、黄瓜花叶病毒、烟草坏死病毒和粘液瘤病毒。在所有这些研究中，烟草花叶病毒为将病毒视为纯大分子提供了一个关键的参考点 - 这些其他病毒实际上是跟随烟草花叶病毒进入了超速离心机分离病毒的时代。

这项关于烟草花叶病毒的生物物理研究表明，不仅蛋白质，而且包括大量病毒都是均质的分子实体，而不是较小化学单元的异质聚集体。然而，一些植物病理学家对此表示怀疑。在他们关于烟草花叶病毒的第一篇长篇文章中，Bawden和Pirie认为Stanley的分离物发生了聚集。斯坦利在1938年初私下回应鲍登时明确表示，他接受了他们的化学修正以及他们对结晶所需的苛刻沉淀技术的担忧，但不会承认均匀的棒状大分子是离心的产物。

烟草花叶病毒是第一个在电子显微镜下观察到的病毒，结果证实了超速离心的结果。1939 年，Gustav A. Kausche、Edgar Pfannkuch 和 Helmut Ruska 发表的烟草花叶病毒显微照片揭示了330×15纳米的离散棒状颗粒。两年后，斯坦利和托马斯·安德森在RCA电子显微镜上获得了他们自己非常清晰的照片。1946年，斯坦利与诺斯罗普和詹姆斯·萨姆纳（James Sumner）共同获得了诺贝尔化学奖，以表彰他们制备了纯净的的酶和病毒。