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鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用的制作方法

花匠小妙招
2024-11-05 17:12

鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用，本发明研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性，并测定了MIC值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25-50μg/ml，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25-200μg/ml。本发明采用以鞣花酸内服、外用对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型进行治疗，以注射方式对鞣花酸单一给药或与氟康唑共同给药对小鼠真菌感染模型的治疗作用进行研究。其结果表明，鞣花酸内服、外用均对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型有一定疗效。
【专利说明】鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]鞋花酸的分子式C14H608,英文名:ellagicacid,化学名:2，3，7，8-tetrahydroxybenzopyrano-5, 4, 3_cde benzopyran-5, 10-dione。微溶于水、醇，溶于喊、吡卩定，不溶于醚。
[0003]鞣花酸可由地锦草、斑地锦、黑莓、覆盆子、草莓、蔓越莓、山核桃、石榴、枸杞等植物中提取制得，也可由化学合成制得。
[0004]随着社会进步和人们生活水平的提高，人们愈来愈关注健康和生活的质量，真菌感染疾病是一种常见病、多发病，近年来呈逐渐上升的趋势，然而随着抗真菌剂的广泛应用，临床耐药菌株不断增多，加之致病真菌对现有药物的耐药性日趋严重，使得真菌感染易于发生并难于控制。目前临床上应用的抗真菌药物在一定程度上起到了控制致病真菌感染的作用，但还存在很多不足，如两性霉素B具有严重的肾毒性；氮唑类药物在抑制真菌的同时对哺乳动物的细胞色素P450系统也具有抑制作用，进而产生毒副反应，少数使用者还可出现严重的肝毒性；酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等均有引起肝坏死或肝毒性致死的报道。目前，在天然活性成分中寻找新的高效低毒抗真菌新药物已成为近年来抗真菌药物研究的热点和趋势。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种鞣花酸在治疗和预防人体真菌和细菌感染的药物中的应用，本发明采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑为阳性对照药，研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性,并测定了 MIC值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25~50 ii g/ml，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25~200 ii g/ml。本发明采用以鞣花酸内服、外用对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型进行治疗，以注射方式对鞣花酸单一给药或与氟康唑共同给药对小鼠真菌感染模型的治疗作用进行研究。其结果表明，鞣花酸内服、外用均对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型有一定疗效，通过苏木精-伊红(HE)染色，碘酸-雪夫(PAS)染色及真菌镜检转阴、治愈率可达88.90%。以注射方式对小鼠真菌感染模型的治疗中鞣花酸单一给药时小鼠死亡率最高为25.0%，最低为8.3%，当与氟康唑合用注射给药时死亡率可控制在0%~16.7%以内。鞣花酸给药方式适用于内服、外用、注射给药，且鞣花酸可用于单一成分入药或与其它药物组合入药，经体内外试验均表明本品抗真菌作用显著。本发明鞣花酸的开发对抗真菌药物临床前景更显重要。`
[0006]本发明所述的一种鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病的药物中的应用。
[0007]鞣花酸用药的纯度为50-100%。[0008]鞣花酸为单一成分入药或与其它药物组合入药。
[0009]鞣花酸入药的临床人日使用量为I U g-20g之间。
[0010]鞣花酸药物的给药方式为内服、外用和注射。
[0011]本发明通过研究鞣花酸对小鼠、豚鼠真菌感染模型的治疗作用，并进行体外对临床常见真菌的最低抑菌浓度(MIC)测定，证实了鞣花酸体内外抗真菌效果显著。
[0012]本发明研究了鞣花酸对小鼠真菌感染模型的治疗作用，通过建立小鼠真菌感染模型，采用腹腔注射给药7天，进行一般状况观察、测定体重，计算死亡率，测定小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。结果显示，各给药组对小鼠真菌感染模型均有一定治疗作用，真菌感染小鼠死亡率最高为25.0%，最低为8.3%，且鞣花酸高剂量(8mg/mL)与模型组相比死亡率显著降低，鞣花酸单用起效剂量为4mg/mL。鞣花酸与临床常用抗真菌药物氟康唑合用，当氟康唑:鞣花酸2:1时可明显改善造模小鼠的一般症状，体重比模型组显著增加，死亡率为0%，SOD活性及MDA含量与正常小鼠接近。鞣花酸与氟康唑合用起效剂量为氟康唑:鞋花酸=2mg/mL:2mg/mL,综上,鞋花酸单用或与氟康唑合用均可显著降低小鼠真菌感染死亡率、改善其症状。
[0013]另外，通过建立豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型，采用外用、口服给药7天，以皮肤病变程度、治愈率和真菌镜检转阴率为评价指标，观察鞣花酸以与对豚鼠皮肤癣菌感染模型的治疗作用。结果显示，鞣花酸外用高剂量组(0.4g软膏/cm2)治愈率为88.90%,中剂量(0.2g软膏/cm2)为87.50%，低剂量(0.1g软膏/cm2)为77.80%。鞣花酸灌胃高剂量组(15mg/kg)治愈率为 88.90%,中剂量(7.5mg/kg)为 77.78%，低剂量(3.75mg/kg)为 66.67%，病理观察鞣花酸外用与灌胃高、中剂量可明显改善感染组织皮肤毛囊生长情况，综上，鞣花酸对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染治疗效果显著。
[0014]体外试验采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑为阳性对照药，研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性`，并测定了最低抑菌浓度(MIC)值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25~50 ii g/ml，而临床常用抗真菌药物氟康唑对这6种皮肤癣菌的MIC值范围也为6.25~50 ii g/ml。由此可见，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感，作用于氟康唑相当。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25~200 u g/ml，而氟康唑对念珠菌的MIC值范围为12.5~50 ii g/ml，但氟康唑临床在治疗念珠菌感染时周期较长，副作用较大，临床上有引起肝坏死或肝毒性致死的报道，该类抗生素很易出现耐药性，天然耐药菌株不断增加，因此，鞣花酸的开发对抗真菌药物临床前景更显重要。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为本发明各组豚鼠造模后一般观察与皮肤镜检图；
[0016]图2为本发明各组膝鼠治疗后光镜下形态学图(HE, X 400)图；
[0017]图3为本发明各组豚鼠治疗后光镜下形态学图(PAS，X400)图。
【具体实施方式】
[0018]实施例[0019]鞣花酸体内外抗真菌作用的实验研究:
[0020](一)鞣花酸体外抗真菌实验研究:
[0021]摘要目的:对鞣花酸进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度(MIC)值。方法:采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》，即M38-A方案。在此方案的基础上测定鞣花酸对17株临床常见皮肤癣菌以及6株念珠菌的MIC值。结果:鞣花酸对皮肤癣菌中不同菌种的MIC值范围为6.25-100 Ug/ml ;对念珠菌中不同菌种的MIC值范围为25-200 ii g/ml。结论:鞣花酸体外具有显著抗真菌作用。
[0022]关键词:鞣花酸；体外抗真菌作用；最小抑菌浓度；
[0023]1.材料与仪器
[0024]1.1实验菌种:菌种来源:本实验所采用皮肤癣菌菌株均来自新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库。念珠菌菌株均由新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。
[0025]以上共计23株，菌株名称、来源及编号见附录A。
[0026]1.2实验材料:鞣花酸(上海源叶生物科技有限公司，YY13933)。二甲基亚砜(DMSO)(天津永晟精细化工有限公司，20110330)。特比萘芬(TBF)由(上海诚优国际贸易有限公司，20090101)提供。氟康唑氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司，B12070605)。马铃薯培养基(PDA)(碧迪医疗器械有限公司，2263097) ；RPM1-1640液基(Invitrogen公司，31800-022)。
[0027]1.3实验仪器:DM2500显微镜(德国LEICA);FM型生化培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；BHC-1300 II A型生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)；LDZX-75KBS (内循环)立式蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；BS224S型精密电子天平(德国Sartorious)。
[0028]菌种活化:皮肤癣菌:将来自菌种保藏库的菌株挑取直径约3mm菌丝体，以点接种法接种于新制备的马铃薯培养基(PDA)试管斜面中央，温度28°C培养7-14d后进行药敏实验。实验所需菌株:红色毛癣菌6株，石膏样毛癣菌6株，紫色毛癣菌I株，许兰毛癣菌I株，疣状毛癣菌I株，犬小孢子菌I株，须状毛癣菌I株。均由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心囷种保减库提供。
[0029]念珠菌:将来自菌种保藏库的菌株挑取卜2个菌落，以划线接种法接种于新制备的马铃薯培养基(PDA)试管斜面中央，温度36°C培养，时间48h后进行药敏实验。白色念珠菌I株，光滑念珠菌I株，近平滑念珠菌I株，热带念珠菌3株。均由新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。
[0030]2.实验方法
[0031]根据NCCLS《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(M38-P)方案在测定鞣花酸对17株临床常见皮肤癣菌以及6株念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值。
[0032]2.1抗真菌药物储备液、稀释液的制备
[0033]称取鞣花酸标准品50.0mg,用ImL DMSO溶解，制成浓度为50000 u g ? mL—1的储备液，存于温度_70°C冰箱备用；称取TBF8mg，用ImL DMSO溶解，制成浓度为8000 u g -m^1的储备液，存于温度_70°C冰箱备用。
[0034]临用前将鞣花酸和TBF储备液，分别用RPM1-1640培养基倍比稀释成2倍试验终浓度，鞣花酸的2倍终浓度由高向低依次为:200、100、50、25、12.5,6.25,3.125、1.5625 u g/ml ；TBF 的 2 倍终浓度由高向低依次为 0.16,0.08,0.04,0.02,0.01,0.005、0.0025,0.000625 u g/ml,氟康唑的2倍终浓度由高向低依次为:200、100、50、25、12.5、
6.25、3.125、1.5625 u g/ml。
[0035]2.2菌接种液的制备:
[0036]皮肤癣菌:将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培养基斜面上，温度28°C培养7-14d，吸取2mL无菌的0.85%的NaCl溶液，轻轻冲洗菌落表面的菌丝和孢子，吸取菌液转移至无菌试管中，振荡器上振荡15s，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至0.4X IO6~5X IO6Cfu ? mL-1之间，用RPM1-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。
[0037]念珠菌:将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基斜面上，温度36°C培养48h,挑取菌落，加入2mL无菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5#McFarland standard比池管比池，用RPM1-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。
[0038]2.3 接种:
[0039]将100 的2倍终浓度的药液，由第I孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中；
[0040]第11孔为生长对照孔(仅加菌接种液100 U I和RPM1-1640培养基100 yl);
[0041]第12孔为空白对照孔(只加RPM1-1640培养基200 yl);·[0042]将调好的菌接种液100 iil，分别加入相应的微孔内，这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液(2倍终浓度)分别被1:1稀释到终浓度。
[0043]2.4培养条件和结果判定:
[0044]皮肤癣菌于温度28°C孵育7-14天读结果；念珠菌于温度36°C孵育48小时读结果。
[0045]读取MIC值时，应在不搅动的情况下与对照孔按比较，溶液清晰透明视为真菌完全不生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。
[0046]3.实验结果:
[0047]表1鞣花酸、氟康唑和TBF对23株真菌的药物敏感性
【权利要求】
1.一种鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸用药的纯度为50-100%。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸为单一成分入药或与其它药物组合入药。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸入药的临床人日使用量为IU g-20g之间。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸药物的给药方式为内服、外用、注射。
【文档编号】A61P31/04GK103622955SQ201310660593
【公开日】2014年3月12日申请日期:2013年12月9日优先权日:2013年12月9日
【发明者】斯拉甫·艾白, 李治建, 古力娜·达吾提申请人:新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所