菊花转录因子CmTGAs的克隆及同源遗传转化研究
摘要菊花(Chrysanthemum 摘要 菊花(Chrysanthemum morifo以“m Rarnat．)是原产我国的传统花卉，集观赏、药用、食 用于一体。在生产实践中，病害成为影响其产量和品质的重要因素，黑斑病是主要病害 之一。水杨酸(SA)介导的系统获得抗性(SAR)能使植物获得对病原的广谱抗性，转 录因子TGA在SA介导的SAR中起重要的调节作用。本研究以原产河南省焦作市怀区 的优良品种小黄菊(Huaiqing yellow chrysanthemum)为试材，对其SAR调节基因CmTGAs 进行了系统研究，并对其黑斑病原菌进行了分离纯化，取得了如下研究结果： 1．分离到三个CmTGAs类基因全长，分别为CmTGAl、CmTGA5、CmPAN。采用 Race法克隆到CmTGAl、CmTGA5、CmPAN三个基因，与已知基因序列进行同源性比 对，同源性分别可达到61％，80％，65％，通过对编码区氨基酸序列进行分析发现，亮 氨酸拉链保守区分别在N端第70一100、40—80、150—195个氨基酸，D亚族特征序列 分别位于N端第340--351、309--321、420--430个氨基酸。 2．构建了CmTGAs的过表达载体、获得了转化菌株。利用酶切、连接的方法构建了 转基因载体superl300．GFP—CmTGAs，通过冻融法将superl300．GFP．CmTGAs导入农杆 菌GV3101中。 3．建立了小黄菊的胚状体高频再生及受体再生体系。最佳胚状体诱导培养基组合为 MS+1．5 mg／L IAA+0．5 metE 6-BA+1．0 merlE 2,4一D，最适诱导时间为10 d，诱导率可 达80％，诱导后在去除2，4．D的分化培养基上，芽的分化率可达75％。以此为基础，进 一步优化了受体再生体系，确定以5．0 mg／L潮霉素(HmB)为芽分化选择压、4．5 mg／L潮 霉素为生根选择压、头孢霉素(Ce￡)最适抑菌浓度为100 mg／L。 4．进行了CmTGAl的同源转化，获得了抗性植株。将小黄菊叶块在IM诱导培养基 上预培养3 d，用摇至OD600=0．5．0．7工程菌侵染10 min，黑暗共培养2 d，在含100 mg／L Ceil和1．0 mg／L HmB的IM上，诱导5 d转接到含100 mg／L Cef和5．0 mg／L HmB的RM 分生培养基筛选培养，待愈伤组织分化出不定芽后转到含100 mg／L Cef．和10．0 mg／L HmB DM发育培养基上生长两周左右，转到含50 m∥L Cef．和4．5 mg／L HmB RTM生根 培养基中进行生根筛选培养。共获得抗性植株23株，18株具有明显绿色荧光蛋白。 5．利用组织分离纯化法分离得到两个小黄菊黑斑病病原菌菌株A1和A2。用组织 分离法共获得3个菌株，柯赫氏法则鉴定其中2个菌株为黑斑病致病菌；通过形态观察 和产孢表型观察判断A1和A2均为链格孢属真菌；通过ITS序列进化树分析，证实了 和产孢表型观察判断A1和A2均为链格孢属真菌；通过ITS序列进化树分析，证实了 为菊花黑斑病病原菌，为转化植株的抗病性生物学检测提供了病原基础。 关键词：小黄菊，CmTGAs基因，胚状体途径，克隆，遗传转化，黑斑病病原菌 ABSTRAC ABSTRAC T Chrysanthemum morifolium Ramat．is traditional flower originated from China．These flowers be used ornamental，medicinal and edible plants．In productive practice，a variety of diseases the major biological stress factors in limiting yield and quality．Black spot disease of Chrysanthemum is of major diseases．Systemic acquired resistance(SAR)mediated by salicylic acid(SA)can make plants obtained the broad spectrum resistance against pathogens．TGA transcription factor plays important role in SA-mediated SAR．In this study,as good quality cultivar,Huaiqing yellow chrysanthemum，which is from Henan province Jiaoz
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