首页 > 分享 > 一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法与流程

一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法与流程

花匠小妙招
2024-11-08 15:26

本发明涉及中药材栽培技术领域，具体涉及一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法。

背景技术：

淫羊藿(epinediumlinn.)为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，别名三枝九叶草、羊藿叶，仙灵脾，铁打杵等。根状茎粗短或横走，质硬、多须根，褐色；茎单生或数茎丛生，光滑，基部被有褐色鳞片，其茎叶入药，具有补肾壮阳、壮筋骨、祛风湿的功效。现代医学研究表明，淫羊藿中的主要有效成分--淫羊藿苷能够防治心脑血管疾病，提高免疫力，增强骨代谢，防止骨质疏松的发生。此外，其在抗肿瘤、抗氧化和抗衰老方面也有一定功效。除了药用价值之外，淫羊藿还具有奇特的姿态，叶和花具有较高的观赏价值，因此作为新型园林植物大力开发也很有前景。目前，淫羊藿作为药材主要依靠采挖野生资源，致使其在主要产地逐年减少，对资源和生态都破坏较大。积极开展淫羊藿的人工栽培和建立快速繁殖技术不仅能取得更好的经济效益，同时对生态的恢复也有促进作用。

淫羊藿种子有明显的休眠现象，自然条件下约1年才能出苗，且出苗率低，主要是因为种胚的形态后熟并且种子内含有萌发抑制物质。目前报道的关于打破淫羊藿种子休眠的方法主要是沙藏层积、变温层积和激素处理等。然而，淫羊藿在以地下根茎无性繁殖时，易受到细菌、真菌、植株来源、生长环境等因素制约，因此种子繁殖和根茎繁殖均难以实现规模化生产。另外，植物组织培养方法中，液体培养相对固体培养来说营养元素利用率更高，使植物增殖更迅速，生长快、健壮等，但是，液体培养基的通气不好，要进行震荡，往往玻璃化严重，近年发展起来的浸没式培养虽然在一定程度上解决了气体交换问题，但仍然存在溶解氧量少、剪切力大对培养物不利的影响。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法，能够提高淫羊藿种子萌发率和组培繁殖率，实现淫羊藿的规模化生产。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法，包括以下步骤：

(1)将破除休眠的淫羊藿种子作为外植体接种于含链霉素或青霉素的缓冲培养基中培养，获得淫羊藿种胚；

(2)利用淫羊藿种胚经愈伤组织诱导和增殖、丛生芽分化、丛生芽增殖、生根培养以及组培苗驯化后移栽入育苗基质中进行培养得到淫羊藿试管苗；所述丛生芽增殖以及生根培养承载培养基的培养装置采用气雾组培装置。

优选的，所述破除休眠具体为：采用含有20mg/l氟啶酮和500mg/l赤霉素的溶液浸种24～36h后沙藏层积88-95天。

优选的，所述链霉素或青霉素的浓度为链霉素0.1g/l或青霉素400mg/l。

优选的，所述缓冲培养基的配方为：ms+链霉素0.1g/l或青霉素400mg/l+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。

优选的，所述愈伤组织诱导的培养基配方为：1/2ms+1.2-2.0mg/l6-ba+0.8-1.5mg/l2,4-d+0.1-0.5mg/liba+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。

优选的，所述丛生芽增殖的培养基配方为：ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1。

优选的，所述生根培养的培养基配方为：1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。

优选的，所述丛生芽增殖以及生根培养的条件为：温度23℃-25℃，湿度75％-85％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500lx。

优选的，所述育苗基质为草炭、珍珠岩和蛭石的混合物，所述草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为2:1:1。

优选的，所述移栽入育苗基质中进行培养的条件为：光照强度为1500-3000lx，光照时间为10-14h/d，培养室温度为20-24℃。

本发明的有益效果：

本发明所述方法通过在培养基中添加链霉素或青霉素，对淫羊藿组培快繁体系进行优化，显著降低了淫羊藿组织培养初期的试管苗污染率，提高了淫羊藿试管苗的品质和成活率。本发明采用气雾组培装置增加了溶解氧，有利于培养物的生长和发育，能协调液相和气相矛盾，增强了气体交换，使培育的淫羊藿植株更健壮，有利于淫羊藿植株更快适应外界环境，试管苗的移栽成活率达到92％。

具体实施方式

本发明提供了一种快速繁育淫羊藿试管苗的方法，包括以下步骤：

(1)将破除休眠的淫羊藿种子作为外植体接种于含链霉素或青霉素的缓冲培养基中培养，获得淫羊藿种胚；

在本发明中，所述破除休眠优选为采用含有氟啶酮和赤霉素的溶液浸种后进行沙藏层积；所述氟啶酮和赤霉素优选为20mg/l氟啶酮和500mg/l赤霉素；所述的浸种时间优选为24-36h，更优选为28-32h；所述沙藏层积的时间优选为88-95d，更优选为90d。

本发明破除休眠状态的淫羊藿种子作为外植体前，优选的需要进行消毒。本发明中消毒优选为初步消毒和彻底消毒；初步消毒优选为将淫羊藿种子在抑菌剂中进行浸泡；其中，所述抑菌剂优选为2d-106抑菌剂或体积分数为0.1％的hgcl2；彻底消毒优选为先将种子置于酒精中进行浸泡，后置于hgcl2溶液中浸泡；其中，所述酒精优选为体积分数为75％的酒精，hgcl2优选为体积分数为0.1％的hgcl2。

在本发明中，将外植体接种于含链霉素或青霉素的缓冲培养基中进行培养。本发明中所述链霉素或青霉素优选为链霉素0.1g/l或青霉素400mg/l。所述缓冲培养基的配方优选为：ms+链霉素0.1g/l或青霉素400mg/l+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。本发明所述的缓冲培养基中添加有链霉素或青霉素，能够显著降低淫羊藿组织培养初期的试管苗污染率，从而提高淫羊藿的品质和成活率。

为了确定缓冲培养基的配方，作为一种可实施的方式，本发明将已破除休眠的种子分别接种到三种不同配方的缓冲培养基①ms+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0；②ms+链霉素0.1g/l+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0；③ms+青霉素400mg/l+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0中，每种培养基接种50个种子，7天后统计污染率，得到结果如下表：

表1添加青霉素或链霉素对淫羊藿种子污染率的影响

从表1可以看出，不同配方的缓冲培养基对于淫羊藿种子的污染效果不同，而添加青霉素或链霉素能够明显降低淫羊藿种子的污染率，有利于提高淫羊藿的品质和成活率。

在本发明中，利用淫羊藿种胚进行愈伤组织诱导和增殖培养。所述的愈伤组织诱导优选的在诱导培养基中进行，所述的诱导培养基配方优选为：1/2ms+1.2-2.0mg/l6-ba+0.8-1.5mg/l2,4-d+0.1-0.5mg/liba+琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0，更优选为1/2ms+1.5mg/l6-ba+1.0mg/l2,4-d+0.3mg/liba+琼脂7.3g/l+蔗糖28g/l；所述的愈伤组织增殖培养优选的在增殖培养基中进行，所述的增殖培养基配方优选为：ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa琼脂7.0-7.5g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。

在本发明中，经愈伤组织诱导和增殖获得愈伤组织后进行丛生芽分化。所述的丛生芽分化在丛生芽分化培养基中进行；所述的丛生芽分化培养基配方优选为：1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa；所述的丛生芽分化培养时间优选为30-40d，更优选为35-38d。

本发明中，所述的丛生芽增殖和生根培养承载培养基的培养装置采用气雾组培装置。本发明气雾组培装置的利用能够增加溶解氧，协调液相和气相矛盾，增强气体交换，有利于淫羊藿的生长和发育，使培育的植株更健壮，能使植物更快适应外界环境，植株气孔功能更健全，减少玻璃化植株。同时，本发明应用气雾组培装置不用琼脂或者凝胶剂，节省了成本。本发明对气雾组培装置的来源、型号及结构没有特殊限定，现有已知的气雾组培装置均能应用于本发明中。在本发明具体实施例中，本发明所述的气雾组培装置由江苏农林职业技术学院提供。本发明气雾组培装置的工作条件根据不同的型号及工作效率进行合理设定，本发明中优选为每6小时通电工作5分钟。

在本发明中，所述丛生芽增殖和生根培养的培养基优选为用气雾组培装置承载的液体培养基；所述丛生芽增殖的培养基优选为：ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1，ph5.8-6.0；所述生根培养的培养基优选为：1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖25-30g/l，ph5.8-6.0。

为确定生根培养基的不同组成对淫羊藿试管苗的影响，作为一种可实施的方式，本发明将经过丛生芽增殖生长至3～5cm的组培苗，接种到不同配方的两种培养基①1/2ms+naa0.5mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂7.0-7.5g/l，ph5.8-6.0；②1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖25-30g/l+琼脂7.0-7.5g/l，ph5.8-6.0中，培养30d，取10株，统计株高和根系数如下表：

表2不同生根培养基对淫羊藿株高和根系数影响

可以看出，不同配方的生根培养基对于淫羊藿的高和根系数具有不同的影响，而添加活性炭能够明显提高淫羊藿试管苗的株高，增加其根系数，有利于提高淫羊藿试管苗的品质和移栽成活率。

在本发明中，所述丛生芽增殖以及生根培养的培养条件优选为：温度23-25℃，湿度75％-85％，光照14-16h/d，光照强度2000-2500lx，更优选为：温度24℃，湿度80％，光照15h/d，光照强度2300lx。

在本发明中，经生根培养及驯化后的淫羊藿组培苗移栽入育苗基质中进行培养。本发明所述的育苗基质优选为草炭、珍珠岩和蛭石的混合物，所述草炭、珍珠岩和蛭石的体积比优选为草炭：珍珠岩：蛭石＝2:1:1；所述移栽入育苗基质中进行培养的条件优选为：光照强度1500-3000lx，光照时间10-14h/d，温度20-24℃；更优选为光照强度2500lx，光照时间12h/d，温度22℃。

实验结果表明，本发明通过对淫羊藿组培快繁体系进行优化，采用气雾组培装置进行气雾培养，显著降低了淫羊藿组织培养初期的试管苗污染率，提高了淫羊藿试管苗的品质和成活率，移栽后的试管苗生长健壮，移栽成活率达到92％。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中淫羊藿来自甘肃岷县、兴隆山地区；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)取种粒饱满、无病害、成熟脱落的淫羊藿休眠状态种子用含有20mg/l氟啶酮+500mg/l赤霉素的溶液浸种24h打破休眠，然后室外沙藏层积90d左右。

(2)以休眠解除状态种子为外植体，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，将种子装入网袋中浸入2d-106抑菌剂中浸泡3h，然后取出用无菌水冲洗干净，进行初步消毒；在超净工作台中将种子置于体积分数75％酒精中，振荡烧杯，使酒精与外植体表面充分接触，30s后用无菌水反复清洗3次；用体积分数0.1％hgcl2对种子彻底消毒6min，用无菌水反复清洗3次；将消毒后的外植体放置在无菌滤纸上，待水分被吸干，用经过灭菌的镊子将消过毒的种子接种到ms+链霉素0.1g/l+琼脂7.0g/l+蔗糖25g/l，ph5.8-6.0的缓冲培养基中，得到淫羊藿种胚。

(3)将步骤(2)获得的种胚转接到1/2ms+1.2mg/l6-ba+0.8mg/l2,4-d+0.1mg/liba+琼脂7.0g/l+蔗糖25g/l，ph5.8-6.0的愈伤组织诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织后，将其转接到ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa琼脂7.0g/l+蔗糖25g/l，ph5.8-6.0的增殖培养基上进行愈伤组织增殖；其中，诱导和增殖培养条件为：温度23℃，湿度75％，光照14h/d，光照强度2000lx。

(4)将步骤(3)获得的绿色可见愈伤组织分割转接到1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa的丛生芽分化培养基中培养30d，得到淫羊藿不定芽；丛生芽长至2cm时，在无菌条件下将丛生芽切成单株，接种到ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1的增殖培养基的气雾装置承载网上进行增殖，根据对组培苗数量的要求，每隔30天按同样方法进行组培苗再增殖培养。

(5)将生长至3cm的组培苗，接种到1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖25g/l，ph5.8-6.0培养基的气雾装置承载网上进行生根培养；培养条件为：温度23℃，湿度75％，光照14h/d，光照强度2000lx。

(6)当组培苗生长至5cm时，先进行组培苗的驯化，再移栽入体积比为草炭：珍珠岩：蛭石＝2:1:1的育苗基质中进行培养得到淫羊藿试管苗。

实施例2

(1)取种粒饱满、无病害、成熟脱落的淫羊藿休眠状态种子用含有20mg/l氟啶酮+500mg/l赤霉素的溶液浸种36h打破休眠，然后室外沙藏层积90d左右。

(2)以休眠解除状态种子为外植体，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，将种子装入网袋中浸入体积分数为0.1％的hgcl2中浸泡6min，然后取出用无菌水冲洗干净，进行初步消毒；在超净工作台中将种子置于体积分数75％酒精中，振荡烧杯，使酒精与外植体表面充分接触，30s后用无菌水反复清洗5次；用体积分数0.1％hgcl2对种子彻底消毒10min，用无菌水反复清洗5次；将消毒后的外植体放置在无菌滤纸上，待水分被吸干，用经过灭菌的镊子将消过毒的种子接种到ms+链霉素0.1g/l+琼脂7.5g/l+蔗糖30g/l，ph5.8-6.0的缓冲培养基中，得到淫羊藿种胚。

(3)将步骤(2)获得的种胚转接到1/2ms+2.0mg/l6-ba+1.5mg/l2,4-d+0.5mg/liba+琼脂7.5g/l+蔗糖30g/l，ph5.8-6.0的愈伤组织诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织后，将其转接到ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa琼脂7.5g/l+蔗糖30g/l，ph5.8-6.0的增殖培养基上进行愈伤组织增殖；其中，诱导和增殖培养条件为：温度25℃，湿度85％，光照16h/d，光照强度2500lx。

(4)将步骤(3)获得的绿色可见愈伤组织分割转接到1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa的丛生芽分化培养基中培养40d，得到淫羊藿不定芽；丛生芽长至3cm时，在无菌条件下将丛生芽切成单株，接种到ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1的增殖培养基的气雾装置承载网上进行增殖，根据对组培苗数量的要求，每隔45天按同样方法进行组培苗再增殖培养。

(5)将生长至5cm的组培苗，接种到1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖30g/l，ph5.8-6.0培养基的气雾装置承载网上进行生根培养；培养条件为：温度25℃，湿度85％，光照16h/d，光照强度2500lx。

(6)当组培苗生长至8cm时，先进行组培苗的驯化，再移栽入体积比为草炭：珍珠岩：蛭石＝2:1:1的育苗基质中进行培养得到淫羊藿试管苗。

实施例3

(1)取种粒饱满、无病害、成熟脱落的淫羊藿休眠状态种子用含有20mg/l氟啶酮+500mg/l赤霉素的溶液浸种30h打破休眠，然后室外沙藏层积90d左右。

(2)以休眠解除状态种子为外植体，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗后，将种子装入网袋中浸入2d-106抑菌剂中浸泡3h，然后取出用无菌水冲洗干净，进行初步消毒；在超净工作台中将种子置于体积分数75％酒精中，振荡烧杯，使酒精与外植体表面充分接触，30s后用无菌水反复清洗4次；用体积分数0.1％hgcl2对种子彻底消毒8min，用无菌水反复清洗4次；将消毒后的外植体放置在无菌滤纸上，待水分被吸干，用经过灭菌的镊子将消过毒的种子接种到ms+链霉素0.1g/l+琼脂7.3g/l+蔗糖28g/l，ph5.8-6.0的缓冲培养基中，得到淫羊藿种胚。

(3)将步骤(2)获得的种胚转接到1/2ms+1.5mg/l6-ba+1.0mg/l2,4-d+0.3mg/liba+琼脂7.3g/l+蔗糖28g/l，ph5.8-6.0的愈伤组织诱导培养基中进行培养，得到愈伤组织后，将其转接到ms+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa琼脂7.3g/l+蔗糖28g/l，ph5.8-6.0的增殖培养基上进行愈伤组织增殖；其中，诱导和增殖培养条件为：温度24℃，湿度80％，光照15h/d，光照强度2300lx。

(4)将步骤(3)获得的绿色可见愈伤组织分割转接到1/2ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa的丛生芽分化培养基中培养35d，得到淫羊藿不定芽；丛生芽长至3cm时，在无菌条件下将丛生芽切成单株，接种到ms+6-ba1.0mg·l-1+naa0.5mg·l-1的增殖培养基的气雾装置承载网上进行增殖，根据对组培苗数量的要求，每隔40天按同样方法进行组培苗再增殖培养。

(5)将生长至5cm的组培苗，接种到1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭1.0g/l+蔗糖28g/l，ph5.8-6.0培养基的气雾装置承载网上进行生根培养；培养条件为：温度24℃，湿度80％，光照15h/d，光照强度2300lx。

(6)当组培苗生长至8cm时，先进行组培苗的驯化，再移栽入体积比为草炭：珍珠岩：蛭石＝2:1:1的育苗基质中进行培养得到淫羊藿试管苗。

对比例1

该对比例1中所述的步骤与实施例3相似，不同之处在于：该对比例1中，步骤(4)中的丛生芽增殖培养基以及步骤(5)中的生根培养基均采用常规的琼脂培养基，不采用气雾组培装置。

将上述实施例3和对比例1得到的苗高5～8cm、带有5～6条根的淫羊藿试管苗，分别移入温度为10～15℃，湿度为60％～70％的室外阴凉处开盖驯化培养5～7d，然后取出，用清水洗掉小苗上残留的培养基，接着放入400mg/l多菌灵溶液中浸泡20～30min，最后移栽于含有体积比为蛭石：椰糠：泥炭土＝1:1:1基质的育苗穴盘中，淫羊藿试管苗移栽时先在温度21～25℃，光照强度2000～3000lx，湿度60％～70％之间的温室中培养28～35d，待植株长至10cm高时再进行室外大田移栽，移栽时间选择下午5:00～6:00之间，并浇透水。统计实施例3和对比例1试管苗的增殖系数和成活率可得下表：

表3不同培养方式对淫羊藿试管苗移栽成活率的影响

可以看出，本发明所述方法采用气雾组培装置快速繁育淫羊藿试管苗，相较于现有的淫羊藿试管苗繁育方式显著提高了增殖系数，移栽成活率提高了20％以上，最高达到92％。

由上述实施例可知，本发明所述方法通过对淫羊藿组培快繁体系进行优化，采用气雾组培装置进行气雾培养，显著降低了淫羊藿组织培养初期的试管苗污染率，提高了淫羊藿试管苗的品质和成活率，移栽后的试管苗生长健壮，移栽成活率达到92％。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。