IFN

花匠小妙招
2024-11-08 19:12

自新冠肺炎疫情爆发以来，至今已有大半年时间。目前尚无任何直接有效的药物能阻止疫情蔓延。疫苗的研发进程可能直接决定了这场抗疫战的持续时间。全球研究学者对新冠病毒疫苗的研究也正在如火如荼地开展。

新冠病毒疫苗研究

5月22日，医学期刊《柳叶刀》发表了我国军事医学研究院陈薇院士和江苏省疾控中心朱凤才教授团队的新冠疫苗人体试验临床数据结果。为了评估COVID-19 Ad5重组疫苗的有效性，科研人员抽取疫苗注射14天及28天的志愿者血液进行如下几个方面的验证实验：

ELISA-检测血清中抗体针对COVID-19病毒Spike蛋白及RBD区域的结合作用；

疫苗诱导的中和抗体应答通过COVID-19病毒中和试验和假病毒中和试验检测；

IFN-γ Elispot检测PBMC的免疫响应（使用Spike重组糖蛋白分别刺激疫苗接种前后同一志愿者体内PBMC，接种后细胞分泌IFN-γ程度是接种前2倍即认为成功产生免疫效应）；

流式细胞术检测CD4 T cell及CD8 T cell经Spike重组糖蛋白刺激后产生的IL-2、IFN-γ及TNFα；

除针对新冠病毒的Ad5重组蛋白疫苗外，其他病毒的重组蛋白疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等在进入临床或者临床前期的动物实验的研究中，都是选择的IFN-γ ELISpot方法评估疫苗引起的细胞免疫效应。为什么是ELISpot这种方法，不是ELISA?为什么是IFN-γ这个指标，不是其他的细胞因子？

为什么是ELISpot？

在免疫学领域中，相关疾病和疫苗的研究等均是基于体液的免疫应答（Humoral Mediated Immune Response，HMI）和细胞介导的免疫应答（Cell Mediated Immune Response，CMI）为基础。在以往的免疫应答研究机制中常使用酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）来检测体液中游离的细胞因子或抗体，但由于游离的循环抗体或细胞因子的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，因此ELISA并不能真实反映体内抗体及细胞因子的实际水平。

自1983年，Sedgwick和Czerkinsky结合了细胞培养技术和ELISA技术，建立了体外检测特异性分泌抗体细胞（Antibody-Secreting Cells， ASCs）和分泌细胞因子（Cytokine，CK）细胞的固相酶联免疫斑点技术（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot），可从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该法及高灵敏度，特异性强，高通量，单细胞水平，功能性检测以及低成本等诸多优点于一身，是研究Th1/Th2的反应，疫苗研制，病毒感染的检测和治疗，肿瘤学，传染性疾病，自身免疫性疾病和器官移植的理想工具。

为什么是IFN-γ？

IFN-γ作为免疫活性细胞分泌的细胞因子在诱导抗病毒免疫中起着重要的免疫调理作用，包括激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞和吞噬细胞等，而在疫苗免疫后机体产生IFN-γ的水平实际上反映辅助性T细胞的活动。因此，检测IFN-γ的水平就是间接地检测辅助性T细胞活性。目前，检测IFN-γ的水平已经逐渐代替各种传统的细胞免疫检测手段，成为检测细胞免疫效果的一种重要方法。

因此，建立IFN-γ ELISpot检测方法，可以作为检测和评价疫苗细胞免疫的有效方法，目前也已成为疫苗引起的细胞免疫效应评估的“金标准”。

IFN-γ ELISpot检测方法

IFN-γ Elispot技术原理：

A.用抗IFN-γ的单克隆抗体包被在检测孔的底部；

B.分离待检测样本的淋巴细胞；

C.将待测细胞放入检测孔，同时加入刺激物。在培养期间，对刺激物有反应的T淋巴细胞就会被激活，开始分泌特定的细胞因子IFN-γ，这些细胞因子同时被板底的单克隆抗体捕获；对刺激物没有反应的细胞则不受刺激，也不分泌特定的细胞因子IFN-γ;

D.移出细胞，板底留下细胞因子的潜在“影像”;

E.加入生物素标记的检测抗体，检测抗体与“影像”上的细胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”的夹心结构；

E.加入链霉亲和素标记的酶溶液，通过链霉亲和素与检测抗体上标记生物素结合，形成复合物；

F.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；

F.斑点计数（可人工计数，也可自动读板计数），数据处理，结果分析。每一个斑点代表了一个对特异抗原有反应的特异性T淋巴细胞。斑点的数目多少就反映了样本的细胞免疫的识别状态：斑点多说明免疫识别状态好，斑点少说明免疫识别状态差或者出现免疫耐受。

Mabtech可提供各种不同种属的IFN-γ ELISpot试剂盒

IFN-γ ELISpot试剂盒

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