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一种利用DhMYB2基因瞬时改变石斛兰花色的方法

花匠小妙招
2024-11-08 23:29

一种利用dhmyb2基因瞬时改变石斛兰花色的方法
技术领域
1.本发明涉及一种利用dhmyb2基因瞬时改变石斛兰花色的方法，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术：

2.石斛属(dendrobium)有超过1500多个种和许多人工杂种，主要生长和种植于亚洲热带、亚热带地区和大洋洲东部。石斛兰花色艳丽，花型多样，保鲜期长，是一种观赏价值极高的花卉，与蝴蝶兰属(phalaenopsis)、文心兰属(oncidium)和卡特兰属(cattleya)并称为世界四大观赏洋兰，在切花、盆花、胸花、花束、配餐花等方面得到广泛应用。花色是石斛兰最主要的观赏性状。石斛兰花色主要有暗红色、紫红色、粉红色、黄色、绿色和白色等，并且有丰富的着色方式，如纯色、有花纹、唇瓣颜色特异等。花青素是石斛兰花朵中的主要色素，控制紫红、粉红、桃红等颜色的形成。近年来育种者关注于改变石斛兰花色和花着色方式。然而利用传统杂交育种要求非常全面地收集育种资源，而且受杂交父母本遗传背景的影响，很难实现花色的定向育种。随着生物技术的迅速发展，利用基因工程技术改良花色和定向培育新花色石斛兰品种将成为可能。
3.r2r3-myb转录因子是决定植物花器官中花青素苷合成时空模式的关键因素。石斛兰花瓣/萼片与唇瓣的着色方式通常不同，这暗示了同一石斛兰花朵中存在着复杂的花青素合成的调控模式。
4.vigs(virus-induced gene siencing，病毒诱导的基因沉默)由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因高度同源的植物内源mrna序列的特异性降解，进而通过表型变异研究目标基因功能。其不依赖于目标植物的遗传转化，是一种快速研究基因功能的有力工具。vigs机制中存在系统沉默信号，可长距离地进行细胞间传递，从而诱发系统的特异性抑制作用，因此不需要在原位做处理。近年来vigs已被开发成为一项快速高通量基因功能鉴定新技术，在植物功能基因组学的研究中得到越来越广泛的应用。在双子叶和单子叶植物中已经建立了很多成熟的vigs技术，在双子叶植物中应用的病毒有烟草脆裂病毒(trv)、黄瓜花叶病毒(cmv)、烟草花叶病毒(tmv)等，在单子叶植物中的雀麦花叶病(bmv)、大麦条纹病毒(bsmv)等，随着vigs技术研究的深入，越来越多的病毒被衍生成病毒载体构建vigs体系。目前在观赏植物中成功应用的vigs载体有2种，即基于烟草脆裂病毒(trv)的载体和基于建兰花叶病毒(cymmv)载体。
5.目前尚未见在石斛兰中成功应用vigs技术，也未见利用dhmyb2基因调控石斛兰花青素苷生物合成，改变花色的报道。

技术实现要素：

6.本发明一个目的是提供抑制dhmyb2蛋白的生物学功能的物质或抑制dhmyb2蛋白编码基因表达的物质的用途。
7.本发明提供了抑制dhmyb2蛋白的生物学功能的物质或抑制dhmyb2蛋白编码基因
interactions,25(6)：738
–
746。
50.实施例1、瞬时改变石斛兰花色的方法
51.一、vigs载体的构建
52.1、dhmyb2-pmd18-t重组质粒
53.以石斛兰品种
‘
红珍珠’(dendrobium
‘
red pearl’)(植株购自海南东方迦南兰花产业有限公司)花芽为材料，利用天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒法提取总rna，使用thermo scientific反转录试剂盒合成cdna，以此为模板。设计全长cdna扩增引物：myb2f1:5'-gcaatgggaaaaaatccgtgc-3'；myb2r1:5'-cgggaaaaaaattctatgacaaa-3'，用上述模板进行扩增。
54.扩增反应程序为95℃3min,95℃30s,60℃30s,72℃1min 30s,35个循环，72℃10min。
55.扩增反应体系：vazyme2
×
phanta max master mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)10μl，正向引物myb2f1和反向引物myb2r1各0.5μl，模板cdna 0.5μl，用无菌水补足总体系20μl。
56.扩增产物进行1％琼脂糖电泳，回收目的条带，利用2
×
rapid taq master mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)为pcr 3'-平末端产物加-a尾，并克隆到-t1载体上(购自全式金生物技术有限公司)，获得dhmyb2-pmd18-t重组质粒并测序。
57.dhmyb2
‑‑
t1重组质粒为将序列1所示的dhmyb2基因插入-t1载体得到的质粒，表达序列2所示的dhmyb2蛋白。
58.2、vigs载体
59.1)插入片段dhmyb2-1至dhmyb2-5的获得
60.与dhmyb2(ky039157)序列比对无误后，以dhmyb2
‑‑
t1质粒为模板，分别以如下引物对进行pcr扩增：
61.myb2vf1：5'-gcaatgggaaaaaatccgtgc-3'，
62.myb2vr1：5'-tcaggtaatttagccatcgga；
63.myb2vf2：5'-ccaacgttaaacatggaaact-3'，
64.myb2vr2：5'-tcattatctgtccgaccgggt-3'；
65.myb2vf3：5'-acaaatgatacaactttgatc-3'，
66.myb2vr3：5'-ttagctattgactcttctgct-3'；
67.myb2vf4：5'-gtggctagtatgattcctgaa-3'，
68.myb2vr4：5'-cgcttgatcaggaaatgaaac-3'；
69.myb2vf5：5'-tgaaagattacaagattttgag-3'，
70.myb2vr5：5'-cttacactgatattatcacata-3'；
71.扩增前，在每对引物的f和r引物的5’端分别加接头attb1：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct和attb2：ggggaccactttgtacaagaaagctgggt。
72.得到如下5个插入片段的同源片段：
73.同源片段attb1-dhmyb2-1-attb2、同源片段attb1-dhmyb2-2-attb2、同源片段attb1-dhmyb2-3-attb2、同源片段attb1-dhmyb2-4-attb2、同源片段attb1-dhmyb2-5-attb2。
74.上述pcr反应程序为95℃4min,95℃30s,60℃30s,72℃20s,35个循环，72℃5min。
75.上述扩增反应体系：vazyme2
×
phanta max master mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)10μl，加接头的正向引物myb2vf和加接头的反向引物myb2vr各0.5μl，模板cdna 0.5μl，用无菌水补足总体系20μl。
76.扩增产物进行2％琼脂糖电泳，回收目的条带。
77.2)vigs载体的构建
78.使用bp clonase
tm
ii enzyme mix[invitrogen，购赛默飞世尔科技(中国)有限公司]将上述5个同源片段分别同源重组到pcymmv-pro60载体中，得到5种重组质粒。
[0079]
上述反应体系如下：pcr产物7μl，pcymmv-pro60载体1μl，bp clonase
tm
ii enzyme mix 2μl，25℃1h，加入1μl蛋白酶k溶液，37℃10min。
[0080]
反应结束将5种重组质粒10μl分别转化大肠杆菌top 10感受态细胞，在100μg/ml的卡那霉素抗性lb培养基上过夜培养至单菌落形成，经pcr检测后测序验证重组质粒插入位置序列正确性，将正确的重组质粒分别命名为如下重组质粒1至重组质粒5，即为5个vigs载体。
[0081]
表达dhmyb2-1的重组质粒1为将同源片段attb1-dhmyb2-1-attb2同源重组到pcymmv-pro60载体的attp1和attp2位点间，得到的质粒；attb1-dhmyb2-1-attb2所示的dna分子核苷酸序列由attb1序列、序列1第1
–
187bp位(dhmyb2-1)和attb2序列组成。
[0082]
表达dhmyb2-2的重组质粒2为将同源片段attb1-dhmyb2-2-attb2同源重组到pcymmv-pro60载体的attp1和attp2位点间，得到的质粒；attb1-dhmyb2-2-attb2所示的dna分子核苷酸序列由attb1序列、序列1第191-311bp位(dhmyb2-2)和attb2序列组成。
[0083]
表达dhmyb2-3的重组质粒3为将同源片段attb1-dhmyb2-3-attb2同源重组到pcymmv-pro60载体的attp1和attp2位点间，得到的质粒；attb1-dhmyb2-3-attb2所示的dna分子核苷酸序列由attb1序列、序列1第463-596bp位(dhmyb2-3)和attb2序列组成。
[0084]
表达dhmyb2-4的重组质粒4为将同源片段attb1-dhmyb2-4-attb2同源重组到pcymmv-pro60载体的attp1和attp2位点间，得到的质粒；attb1-dhmyb2-4-attb2所示的dna分子核苷酸序列由attb1序列、序列1第598-744bp位(dhmyb2-4)和attb2序列组成。
[0085]
表达dhmyb2-5的重组质粒5为将同源片段attb1-dhmyb2-5-attb2同源重组到pcymmv-pro60载体的attp1和attp2位点间，得到的质粒；attb1-dhmyb2-5-attb2所示的dna分子核苷酸序列由attb1序列、序列1第758
–
958bp位(dhmyb2-5)和attb2序列组成。
[0086]
插入片段大小dhmyb2-1、dhmyb2-2、dhmyb2-3、dhmyb2-4、dhmyb2-5及在原dhmyb2基因cds序列中的位置如图1所示。
[0087]
二、农杆菌介导的5个pcymmv-pro60重组载体在石斛兰中的瞬时表达
[0088]
1、重组菌的制备
[0089]
采用液氮冻融法将上述一中构建好的5个重组质粒1至5分别转化至农杆菌感受态gv3010(psoup)中(购自上海唯地生物技术有限公司)，在含有100μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平的yeb固体抗性培养基上培养至单菌落形成，挑单菌落在含有100μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平的yeb液体抗性培养基(上海源叶生物科技有限公司，货号r30379)中培养过夜至菌液浑浊，用上述引物和pcr程序分别对菌液进行检测，以确定含有目的质粒。得
到阳性重组菌1至5，重组菌1表达dhmyb2-1，重组菌2表达dhmyb2-2，重组菌3表达dhmyb2-3，重组菌4表达dhmyb2-4，重组菌5表达dhmyb2-5。
[0090]
采用同样的方法将空载体pcymmv-pro60载体转入农杆菌感受态gv3010中，得到转空载体重组菌，命名为gv3010/pcymmv-pro60。
[0091]
2、瞬时转染
[0092]
1)、转染菌液的制备
[0093]
将上述1的阳性重组菌1至5的分别菌液在yeb液体抗性培养基中扩大培养，待od
600nm
值达到0.8以上，5000rpm/min离心5min收集菌体，除去yeb培养基，用ms培养基重悬菌体，再次5000rpm/min离心5min，收集菌体，用ms培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号m8522)重悬，调od
600nm
值达到1.0，得到菌液，再在菌液中加入终浓度为100μm的乙酰丁香酮，在室温黑暗处静置30min，得到重组菌1至5的转染菌液。
[0094]
2)、转染植株的制备
[0095]
以石斛兰品种
‘
迷你’(植株购自海南东方迦南兰花产业有限公司)为植物材料，选取花序抽出10-15cm，花芽尚未开放的植株，抹掉长度1cm以上花芽，保留花序前段幼嫩花芽，得到待转染植株。
[0096]
3)、注射转染
[0097]
以gv3010/pcymmv-pro60菌液为阴性对照，用1ml无菌注射器吸取上述重组菌1至5的转染菌液分别注射至上述2)得到的待转染植株的花梗下方第一片叶背面，每株注射300μl菌液。注射后的植物材料养护于25℃，光照强度20000lux，光照/黑暗时间16h/8h，湿度85％的培养箱中养护至开花。每种转染菌液注射5株。
[0098]
3、表型观察
[0099]
上述2中重组菌1至5的转染菌液注射花25天左右，注射后的植物开出第一朵花色有变化的花，后续每一朵花都比前一朵的变化更明显，已发生变化的花色花会保持到凋谢，如果注射60天以后仍有花朵新开，则颜色恢复。
[0100]
5个插入片段的vigs载体进入
‘
迷你’体内引发的基因沉默反映在花色变化上的效果不同，具体体现如下：
[0101]
注射后25天
‘
迷你’的表型结果如图2a所示，dhmyb2-1至dhmyb2-5分别代表转入表达不同插入片段的重组质粒；转入不同插入片段的花朵呈现如下状态：放射状白色斑块(转入dhmyb2-4、转入dhmyb2-5)、甚至大部分变成纯白(转入dhmyb2-1)、花朵上产生了白色的斑点(转入dhmyb2-2、转入dhmyb2-3)。可以看出，转入dhmyb2-1和dhmyb2-4插入片段的vigs载体的沉默效果在表型效果比其他处理明显。
[0102]
4、分子鉴定
[0103]
将上述3中各个插入片段注射后25天
‘
迷你’分别取长度为2cm左右的花芽为材料，利用天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒法提取总rna，使用primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)(购自宝生物工程(大连)有限公司)将总rna反转录为cdna。使用takara sybr premix ex taqtm ii(tli rnaseh plus)荧光定量试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)分析dhmyb2基因在花芽中的表达水平。以未处理的石斛兰
‘
迷你’为对照。每个株系3株。
[0104]
实时荧光定量pcr检测dhmyb2基因所用的引物如下：
[0105]
dhmyb2-qf：5
′‑
aaggcaaatggacgacggtg-3
′
；
[0106]
dhmyb2-qr：5
′‑
tgtttaacgttgggcctcagg-3
′
。
[0107]
实时荧光定量pcr的扩增反应程序：95℃3min；95℃10s、60℃30s，40个循环。dhmyb2基因的相对表达水平以石斛兰β-actin、tua和cyp，3个基因为内参进行归一化，用2
–△△
ct
法表示基因的相对定量。内参基因引物序列为：
[0108]
actin-qf：5
′‑
gtcagggacatcaaggagaag-3
′
，
[0109]
actin-qr：5
′‑
tgggcacctaaatctctcagc-3
′
；
[0110]
tua-qf：5
′‑
caaagaagatgcagccaacaac-3
′
，
[0111]
tua-qr：5
′‑
aagaccagtgcagttgtcagcta-3
′
；
[0112]
cyp-qf：5
′‑
tctacgccgacacgactcct-3
′
，
[0113]
cyp-qr：5
′‑
ggtgaaaggtagagcccttgaa-3
′
。
[0114]
结果如图2b所示，可以看出，dhmyb2-1至dhmyb2-5分别表示注入不同插入片段的植株，dhmyb2-1和dhmyb2-4两个插入片段的vigs载体沉默效果在基因表达水平比其他处理明显，这与表型结果一致。
[0115]
因此，可以采用dhmyb2-1和dhmyb2-4两个插入片段对石斛兰进行瞬时表达并实现改变花色。
[0116]
实施例2、农杆菌介导的dhmyb2-1和dhmyb2-4的pcymmv-pro60重组载体在石斛兰中的瞬时表达
[0117]
一、瞬时表达改变石斛兰花色
[0118]
选取了实施例1制备的表达dhmyb2-1的重组菌1(od
600nm
值达到1.0)和表达和dhmyb2-4的重组菌4(od
600nm
值达到1.0)，分别注射另两个石斛兰品种“17002”(父母本分别为
‘
泼墨
’×‘
天鹅兰’的杂交种，父母本购自海南东方迦南兰花产业有限公司)和
‘
花儿’(购自海南文心兰生物科技有限公司)，注射方法同实施例1。每个处理注射7株。
[0119]
注射后30天后，使用nf555色差仪c 2
°
光源下利用ciel
*a*b*
表色系统测定的石斛兰多个变色花朵的花瓣和萼片的花色参数：明度l
*
和色相a
*
、b
*
值，并根据公式计算彩度c＝(a
*2
+b
*2
)
1/2
。并参考li等(2016)的方法提取花瓣和萼片的花青素苷并测定含量。[li et al.,2016,isolation andcharacterization of a r2r3-myb transcription factor generelated to anthocyanin biosynthesis in the spathes of anthurium andraeanum(hort.),plant cell rep.,35(10):2151-2165。]
[0120]
以gv3010/pcymmv-pro60菌液进行注射为对照。
[0121]
结果如下：
[0122]
将表达dhmyb2-1vigs载体和表达dhmyb2-4的vigs载体分别导入“17002”和
‘
花儿’中的沉默效果相似，dhmyb2-1处理的表型(具体体现在花色变化)比dhmyb2-4明显(表1，图3)，且总体上“17002”的表型变化也比
‘
花儿’更明显(图3)。
[0123]
石斛兰花瓣和萼片的花色参数结果表达dhmyb2-1vigs载体和表达dhmyb2-4的vigs载体对dhmyb2沉默后，花瓣和萼片的明度l
*
值升高，彩度c值降低，表明花色的明度升高，鲜艳度降低，与对照相比，花色明显变浅，dhmyb2-1对dhmyb2沉默后的颜色变化比dhmyb2-4更明显(图4a，4b)，且从图4的l
*
和c值看出，可以看出花色数据处于一定分布范围，表明形成多种花色。
[0124]
花青素苷含量检测结果：dhmyb2-1处理的“17002”和
‘
花儿’花瓣和萼片中的花青素苷含量也显著低于对照(图4c)。
[0125]
表1为dhmyb2沉默后花色表型阳性率
[0126][0127]
从上述可以看出，表达dhmyb2-1的重组载体沉默后石斛兰花色改变更为明显。
[0128]
二、dhmyb2-1处理30天后“17002”花芽中dhmyb2的沉默效率
[0129]
将上述一中表达dhmyb2-1的重组菌1注射30天后的石斛兰“17002”中的3株植株(dhmyb2-1-1、dhmyb2-1-2、dhmyb2-1-3)，取长度为2cm左右的花芽为材料，利用天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒法提取总rna，使用primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser(perfect real time)(购自宝生物工程(大连)有限公司)将总rna反转录为cdna。使用takara sybr premix ex taqtm ii(tli rnaseh plus)荧光定量试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)分析dhmyb2基因在花芽中的表达水平。以石斛兰“17002”为对照。方法同实施例一。
[0130]
结果如图5所示，可以看出，来自3株不同植株的dhmyb2-1处理后的花芽(dhmyb2-1-1、dhmyb2-1-2、dhmyb2-1-3)，其dhmyb2基因的表达量与对照相比下调明显，幅度最小的下调46％，最大的下调95％，可见vigs介导的dhmyb2基因沉默效果较好。