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博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因及其应用的制作方法

花匠小妙招
2024-11-09 11:25

博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因及其应用。

背景技术：

血根碱和白屈菜红碱主要分布在血根(Sanguinaria canadensis L.)、鸦片罂粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californica Cham.)、白屈菜(Chelidonium majus)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)和博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)当中。最近二十年以来，血根碱已经在欧洲作为替代抗生素的添加剂来促进动物生长。目前博落回是全世界最主要的血根碱的来源植物，并且被欧洲食品安全局列为动物饲用添加剂。血根碱和白屈菜红碱的合成路径在前期研究中已经得到阐明。相关合成基因已经从鸦片罂粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californica Cham.)等植物中克隆，但是尚未有任何基因从博落回中克隆。

技术实现要素：

本发明的目的是提供博落回中参与血根碱和白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因，包括基因Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218，它们的基因序列分别如SEQ ID No.1-5所示。它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No.7-11所示。

本发明提供博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成时提高氧化反应效率的辅酶基因为CPR19967，基因序列如SEQ ID No.6所示，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供含有上述细胞色素P450酶基因的载体，以及上述细胞色素P450酶基因和如SEQ ID No.6所示的辅酶基因CPR19967序列的载体。含有上述细胞色素P450酶基因的工程菌，以及含有上述细胞色素P450酶基因和如SEQ ID No.6所示的辅酶基因CPR19967序列的工程菌。

本发明还提供上述细胞色素P450酶基因，或者它们分别与如SEQ ID No.6所示的辅酶基因CPR19967在血根碱与白屈菜红碱合成中的应用。以及上述细胞色素P450酶基因，或者它们分别与如SEQ ID No.6所示的辅酶基因CPR19967在血根碱与白屈菜红碱体外合成中的应用。

具体应用如下：

基因Mc2661编码博落回中催化N-甲基乌药碱生成3，-羟基-N-甲基乌药碱的N-甲基乌药碱-3，-羟化酶；

基因Mc9485编码博落回中催化四氢非洲防己碱生成四氢小檗碱的四氢小檗碱合酶；

基因Mc217编码博落回中催化金黄紫堇碱生成华紫堇碱的华紫堇碱合酶；

基因Mc11229和Mc11218编码博落回中催化原阿片碱生成二氢血根碱的原阿片碱6-羟化酶；

辅酶基因CPR19967参与博落回血根碱与白屈菜红碱合成时提高氧化反应效率。

在之前的研究中，从去甲乌药碱开始的血根碱与白屈菜红碱的合成途径在罂粟等其它物种中已经清晰，2个化合物共24步反应，其中血根碱与白屈菜红碱从去甲乌药碱开始均经过12步反应合成(包括1步不需要酶参与的自发反应)。其中第1步到第5步反应两者的合成酶相同以及第8到第12步反应两者的合成酶相同。为了找到博落回中合成血根碱与白屈菜红碱的合成基因，我们对博落回植株进行De Novo全基因组测序分析，同时对博落回根茎叶花果实进行了转录组测序。首先以其他物种(罂粟，花菱草)中合成血根碱和白屈菜红碱的细胞色素P450酶基因为参照基因，在博落回基因组中进行BLAST同源比对，找到了14个合成血根碱与白屈菜红碱的细胞色素P450酶候选基因。由于博落回中的血根碱和白屈菜红碱具有组织特异性，2种生物碱均在果荚中含量最高，而2种生物碱的重要前体化合物原阿片碱和别隐品碱在根部中含量最高，而在茎部组织中生物碱含量极低。因此我们推测参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因在博落回中的表达规律也应该是根和果荚中高表达，茎中不表达或者表达量极低。根据这种组织表达特异性，我们从14个候选基因中共筛选出6个符合这种表达规律的基因。然后，我们利用酵母表达体系，在酵母中表达这些候选基因，通过分别饲喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-TOF仪来检测酵母提取物。

我们通过酵母验证了血根碱与白屈菜红碱中的细胞色素P450酶，在通路中共有5步反应属于细胞色素P450酶参与的步骤，筛选出的6个基因分别是Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725。由于CPR基因是细胞色素P450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入CPR有利于提高氧化反应效率，于是我们将辅酶CPR基因分别和这6个基因构建到酵母菌株中进行表达。完成6个菌株的构建后我们分别饲喂这5步反应的前体化合物N-甲基乌药碱、四氢非洲防己碱、金黄紫堇碱、华紫堇碱、cis-N-甲基刺罂粟碱、原阿片碱、cis-N四氢小檗碱、别隐品碱。之后我们通过UPLC-Q-TOF检测酵母提取物发现在饲喂N-甲基乌药碱的表达Mc2661的酵母提取物中检测到了下游产物3，-羟基-N-甲基乌药碱，以及在饲喂四氢非洲防己碱的Mc9485的酵母提取物中检测到了下游产物四氢小檗碱，在饲喂金黄紫堇碱的Mc217的酵母提取物中检测到了下游产物华紫堇碱，在饲喂原阿片碱的Mc11229、Mc11218的酵母提取物中检测到了下游产物二氢血根碱，在饲喂别隐品碱的Mc11229、Mc11218的酵母提取物中检测到了下游产物二氢白屈菜红碱，而在空白酵母中未检测到任何一步反应的下游产物。然而有两步反应SPS和MSH未能找到正确的基因，这可能与这两步反应不适合酵母表达体系有关。因此我们认为Mc2661是博落回中催化N-甲基乌药碱生成3，-羟基-N-甲基乌药碱的N-甲基乌药碱-3，-羟化酶(NMCH)，Mc9485是博落回中催化四氢非洲防己碱生成四氢小檗碱的四氢小檗碱合酶(TDC)，Mc217是博落回中催化金黄紫堇碱生成华紫堇碱的华紫堇碱合酶(CFS)，Mc11229、Mc11218是博落回中催化原阿片碱生成二氢血根碱的原阿片碱6-羟化酶。同时，我们还将博落回中催化原阿片碱和别隐品碱生成血根碱和白屈菜红碱的原阿片碱6-羟化酶(McP6H)与罂粟和花菱草中催化这2步的二氢苯并菲啶氧化酶(PsP6H)、(EcP6H)进行效率比较，发现表达Mc11229的酵母中产生的血根碱和白屈菜红碱的量要大于表达Mc11218和PsP6H以及EcP6H的酵母。证明博落回中原阿片碱6-羟化酶(McP6H)具有更高的催化效率。而Mc10725表达酵母中不产生这几步反应中任何一步的底物，因此不参与合成血根碱与白屈菜红碱。

本发明首次在博落回基因组中发现参与血根碱与白屈菜红碱合成的5个细胞色素P450酶基因,包括Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218，以及提高氧化反应效率的辅酶基因CPR19967。利用酵母体系验证了血根碱和白屈菜红碱合成中细胞色素P450酶参与的5步反应，可实现血根碱和白屈菜红碱的合成。本发明进一步揭示了博落回中血根碱合成的分子机制，为高含量血根碱和白屈菜红碱博落回育种提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料；同时还为血根碱和白屈菜红碱的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植物材料中提取血根碱的方法，实现体外合成血根碱。

附图说明

图1为血根碱与白屈菜红碱合成通路图，两个化合物有部分合成通路相同，而本发明是从中间产物乌药碱开始研究，箭头上分别标出细胞色素P450酶参与的步骤共5步反应。

图2为本发明通过分析RNA-Seq数据，从博落回基因组中发现与血根碱与白屈菜红碱合成相关的细胞色素P450酶基因的候选基因；

图3为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc2661酵母与空白酵母提取物中参与血根碱与白屈菜红碱合成第3步反应，即N-甲基乌药碱至3-羟基-N-甲基乌药碱的结果；

图4为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc217酵母与空白酵母提取物中参与血根碱与白屈菜红碱合成第6步反应，即金黄紫堇碱至华紫堇碱的结果；

图5为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc9485酵母与空白酵母提取物中参与白屈菜红碱合成第6步反应即四氢非洲防己碱至四氢小檗碱的结果；

图6为本发明利用UPLC-Q-TOF检测表达Mc11229、Mc11218酵母与空白酵母提取物中参与血根碱合成第10步反应即原阿片碱至二氢血根碱的结果，以及白屈菜红碱合成第17步反应即原别隐品碱至二氢白屈菜红碱的结果。同时，结果显示表达Mc11229的酵母中产生的血根碱和白屈菜红碱的量要大于表达Mc11218和PsP6H以及EcP6H的酵母。证明博落回中原阿片碱6-羟化酶(McP6H)具有更高的催化效率，而Mc10725表达酵母中不产生这几步反应中任何一步的底物，因此不参与合成血根碱与白屈菜红碱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1参与血根碱与白屈菜红碱合成基因的挖掘与获得

1基因的挖掘

由于血根碱与白屈菜红碱在罂粟和花菱草等植物中的合成路径已知(图1)，相关的功能基因也已经得到克隆。我们以其他物种(罂粟、花菱草)已公开在NCBI的血根碱与白屈菜红碱的细胞色素P450酶基因序列为参照基因，在博落回De Novo全基因组序列中进行BLAST比对，共得到候选基因14条。又由于血根碱与白屈菜红碱在果荚中含量极高，茎中含量极低。前体化合物原阿片碱与别隐品碱在根部含量极高，茎中含量极低。以此为线索，分析博落回根茎叶花果转录组数据(RNA-Seq)从14条候选基因中筛选符合根部和果荚高表达，茎部不表达这一表达模式的基因，共得到6条(图2),分别是Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725。

根据罂粟中已报道的CPR序列在博落回De Novo全基因组序列中进行BLAST比对，得到CPR19967候选基因。CPR基因(SEQ ID No.6)是P450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入CPR有利于提高氧化反应效率。

2博落回Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725、CPR19967以及用于效率比较的罂粟中PsP6H(AGC92397)和花菱草EcP6H(BAK20464)基因的获得。

首先制备博落回根部和果荚cDNA文库，罂粟和花菱草基因来自于人工合成(金唯智公司)，然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩增(引物序列见表1)。

表1引物序列(5′-3′)

PCR反应体系以20μl计为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。

PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃2分30秒，35个循环；72℃10分钟。

将扩增得到的片段与pYES2载体(Invitrogen)连接，测序确认没有突变。

实施例2利用酵母表达系统验证血根碱与白屈菜红碱合成候选基因的功能，比较博落回与罂粟和花菱草中相关基因的转化效率

将Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725分别与辅酶CPR基因构建到表达载体pYES2(Invitrogen)上，并转化酵母菌。诱导酵母表达蛋白，然后进行前体饲喂收集酵母。裂解后用甲醇抽提化合物。样品制备好后用UPLC-Q-TOF进行检测。结果分别如图3-图6所示。利用酵母表达系统比较博落回中Mc11229、Mc11218与罂粟中PsP6H和花菱草中EcP6H的转化效率(图6)。

CPR19967基因(SEQ ID No.6)是P450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入CPR19967有利于提高氧化反应效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列说明：

SEQ ID No.1-6分别为Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218、CPR19967基因序列。

SEQ ID No.7-12分别为基因Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218、CPR19967编码的氨基酸序列。