2023年11月22日，团队联合德国马普发生物研究所（图宾根） Detlef Weigel 实验室在 Cell Press 旗下期刊 Molecular Cell 在线发表题为 "Small proteins modulate ion channel-like ACD6 to regulate immunity in Arabidopsis thaliana" 的研究论文。
钙信号作为细胞重要的第二信使，在动植物生长发育和免疫调控中扮演重要角色，控制钙离子内/外流的离子通道是其中的重要组分。近年来植物免疫领域鉴定并解析了多个钙通道在植物免疫中的作用机制，包括在动植物中广泛分布的 GLR (Glutamate Receptor-Like Proteins) 家族和 CNGC (Cyclic Nucleotide-Gated Ion Channel) 家族钙通道、植物特有的OSCA (Hyperosmolality-induced [Ca2+]cyt increase channel) 家族钙通道、NLR (Nucleotide-Binding Domain Leucine-Rich Repeat Receptor) 抗病小体构成的钙通道以及非经典钙通道蛋白卫青 (WeiTsing)。除此之外，植物中还存在一类蛋白与动物 TRP (Transient Receptor Potential) 钙通道蛋白家族具有相似的堆积结构，即 ANK 重复结构串联多次跨膜结构的蛋白 (ANK-TM)，抗病蛋白 ACD6 (Accelerated Cell Death 6) 就是其中一个典型代表。这类蛋白在植物中广泛参与了植物免疫反应的调控，其是否类似 TRP 蛋白具有钙通道活性，并通过其钙通道调控植物免疫反应还是未知的。
编码多次跨膜蛋白的基因 ACD6 是拟南芥中调控植物免疫与生长平衡的重要基因，现有的研究表明 ACD6 可能与模式识别受体组成复合体参与植物免疫反应的调节，贡献对多种植物病原菌的抗性 (Rate et al., 1999, Plant Cell; Zhang et al., 2014, Molecular Plants)。拟南芥生态型 Est-1 基因组编码的 ACD6-Est-1 由于跨膜结构域的两个关键氨基酸的变异，可以增强植物对病原菌的抗性，同时导致拟南芥出现自免疫表型 (Todesco et al., 2010, Nature)。但是，并不是所有含有这两个氨基酸变异的生态型均具有自免疫表型，暗示自然群体中存在调控 ACD6-Est-1 活性的遗传因子 (Zhu et al., 2018, PLoS Genetics)。为定位 ACD6-Est-1 的遗传抑制因子，作者利用拟南芥野生群体重测序数据 (https://1001genomes.org/) 分析了超过1000个拟南芥生态型的 ACD6 基因组序列，确定了携带 ACD6-Est-1 基因型的84个拟南芥生态型，并针对该群体的自免疫表型进行了全基因组关联分析 (GWAS in sub-population)，克隆并验证小肽编码基因 MHA1 (Modifier of Hyperactive ACD6 1) 的自然变异调控 ACD6-Est-1 的功能。
图 1 小肽MHA1和MHA1L通过跨膜蛋白ACD6调控植物免疫反应
小肽 MHA1 编码基因在不同植物中广泛分布，且多数十字花科植物含有两个拷贝基因，即 MHA1 和 MHA1L (MHA1 Like)。通过对拟南芥 MHA1 和 MHA1L 的单突变体和双突变体的分析发现，MHA1 和 MHA1L 参与调节拟南芥分子模式激活的免疫反应 (PTI, Patterns-triggered immunity)，其中 MHA1L 起主要作用，并且过表达 MHA1L 可以增强植物免疫反应导致低温敏感的自免疫表型。随后，作者针对 MHA1L 过表达材料进行了 EMS 处理筛选了72表型恢复突变体，为寻找抑制 MHA1L 过表达介导自免疫表型的遗传抑制因子，作者采取了一个快速基因定位的策略：即不采用传统构建分离群体的遗传分析方法，而是直接对72个抑制子进行基因组重测序，通过比对不同抑制子携带的突变，发现超过一半抑制子 (37/72) 的 ACD6 基因均携带 EMS 诱发的突变，暗示 ACD6 基因可能是 MHA1L 的下游调控组分。随后的遗传和生化分析进一步验证和明确了 MHA1L 通过直接结合并促进 ACD6 多聚化的分子机制。值得一提的是，沙特阿卜杜拉国王科技大学王亚军博士（现中国科学院分子植物卓越中心PI）最近关于小麦叶锈病抗性基因定位的工作也用到类似“不依赖分离群体快速定位基因”的研究方法 (Wang et al., 2023, Nature Genetics)。
图 2 MHA1L-ACD6分子模块通过调控ACD6的钙离子通道活性调控植物免疫反应
这种小肽分子激活跨膜蛋白的工作模式促使作者思考 MHA1L 和 ACD6 之间的关系是否类似于哺乳动物的小肽门控通道。通过对 ACD6 蛋白结构的预测和比对，发现 ACD6 和哺乳动物 TRPA 蛋白具有相似的结构堆积方式，由此推测 ACD6 可能具有与 TRPA 相似的生化功能，即离子通道活性。在非洲爪蟾卵母细胞和人类肾细胞 HEK293 表达系统中，均检测到 ACD6 具有钙离子通道活性，并且 ACD6-1 突变或共表达 MHA1L 均可增强 ACD6 钙通道的活性；相应的，降低环境中的钙离子浓度可以缓解拟南芥 acd6-1 突变体的自免疫表型；而且，acd6 和 mha1l 失活突变均导致分子模式 flg22 诱导的钙离子内流信号减弱。这些结果表明 MHA1L 通过调控 ACD6 钙离子通道活性参与植物免疫反应的调控。
图 3 MHA1L-ACD6工作模型
综上，该研究揭示了 ACD6 的钙通道活性及其工作机制，解决了多年悬而未决的科学问题；同时发现了植物钙通道的新工作模式：小肽门控工作模式。小肽门控模式是动物 TRP 通道的重要调控机制，该研究进一步将这种机制扩展到植物当中。同时由于 MHA1L-ACD6 同源蛋白在植物中广泛存在，该研究为 ACD6 类似蛋白 ANK-TM 的生物学功能研究提供了理论基础，将为作物抗病机制的研究提供新的思路，并为创造新的抗病作物提供潜在的编辑或改良靶标。此外，本研究表明基于自然群体的变异分析可以为理解植物免疫提供新的研究思路；同时，本研究对植物抗病基因定位方法进行了新尝试，即“不依赖分离群体的快速基因定位策略”，为作物抗性基因定位提供了借鉴。
团队陈俊斌博士、德国马普生物研究所（图宾根）李磊博士（现中科院遗传与发育生物学研究所研究员）、美国杜克大学Jong Hum Kim博士（现韩国浦项科技大学助理教授）、德国霍恩海姆大学 Benjamin Neuhäuser 博士为论文共同第一作者，中国农业大学植保学院朱旺升教授和马普生物研究所（图宾根）Detlef Weigel 教授为共同通讯作者。德国霍恩海姆大学刘昶教授和 Uwe Ludewig 教授，美国杜克大学 Pei Zhen-Ming 教授和 He Sheng-Yang 教授等人参与了该工作。感谢中国农业大学生物学院郭岩教授和植保学院陈东钦教授提供相关研究材料。该研究得到了中国农业大学2115人才发展计划、国家重点研发计划和教育部111引智基地的支持。
