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HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用.pdf

花匠小妙招
2024-11-09 23:36

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010458551.8 (22)申请日 2020.05.27 (71)申请人青岛农业大学地址 266000 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人梁文星朱明怡王鲁鲁宋丽敏 (74)专利代理机构青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙) 37264 代理人王晓晓 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/55(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称。

2、一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用 (57)摘要本发明公开了一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到HDA3基因，构建了番茄HDA3基因的过表达载体pK7FW2-HDA3、重组菌株LBA4404-pK7FW2- HDA3及番茄HDA3过表达植株，本发明通过实验证实过表达HDA3基因可以有效提高番茄抗灰霉侵染的能力。与野生型株系相比，过表达植株叶片上的病斑直径明显减小。 qRT-PCR结果表明过表达植株中的灰霉量较野生型植株中明显下降。本发明通过实验证实HDA3基因在提高番茄抗灰霉病方面具有潜在的应用价值，。

3、并为利用HDA3基因培育抗病植株奠定良好的理论和应用基础。权利要求书1页说明书4页序列表5页附图4页 CN 111500626 A 2020.08.07 CN 111500626 A 1.一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述HDA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：（1）构建HDA3基因过表达载体：根据HDA3基因的CDS序列设计引物并进行PCR扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶对其进行酶切，回收酶切产物后与质。

4、粒进行连接，得到HDA3 基因过表达载体；（2）构建HDA3基因过表达重组菌株：将所述HDA3基因过表达载体转化至农杆菌中，得到 HDA3基因过表达重组菌株；（3）构建HDA3基因过表达植株：将所述HDA3基因过表达重组菌株转化番茄子叶，使用抗生素进行筛选并培养至得到再生苗，即得到HDA3基因过表达植株。 3.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中引物的序列为 HDA3 -F： 5 - ATGGACTCCT CCACCGTAGA CG -3 ； HDA3 -R： 5 - GGAGATAATA TCAGTTGG。

5、TT GATC -3 。 4.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述质粒为pK7FW2。 5.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述基因过表达载体为pK7FW2-HDA3。 6.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述农杆菌为LBA4404。 7.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中培养的条件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。 8.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵。

6、抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述HDA3基因过表达植株与野生型植株相比，叶片上的病斑直径明显减小。 9.根据权利要求2所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，番茄HDA3基因过表达植株与野生型植株相比，叶片上的灰霉量明显降低。 10.根据权利要求1-9任一项所述的HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述植物为番茄。权利要求书 1/1 页 2 CN 111500626 A 2 一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用技术领域 0001 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染。

7、中的应用。背景技术 0002 番茄是我国重要的经济作物，由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢真菌（又名灰霉菌）引起的番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，是威胁番茄生产的一种毁灭性的腐生型真菌性病害。灰葡萄孢不仅侵染番茄的果实，还会侵染番茄的茎、叶、花等不同的部位，且传播速度快，严重影响番茄的产量和经济效益。灰葡萄孢还有易变异和多型性的特点，容易受环境和寄主的影响而产生新的变异。目前对番茄灰霉病的防治主要是化学防治和农业防治，但防治效果均不理想，因此需要深入研究植物的的抗病机制及其与病原互作的分子机制，为通过基因工程手段控制番茄灰霉病的发生提供依据，从而。

8、为番茄灰霉病的防治提供新的思路。 0003 组蛋白的乙酰化修饰是一种可逆而且高度调控的蛋白质翻译后修饰方式，它主要发生在组蛋白赖氨酸残基的 -NH2位，此可逆的动态修饰由组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和去乙酰化酶（HDACs）调控，共同控制染色质各区域核心组蛋白的乙酰化程度，从而引起染色质结构改变及基因转录活性变化。 0004 目前，真核生物中的去乙酰化酶HDACs分为三大家族：一类是依赖于Zn2+的去乙酰化酶，该家族成员在二级结构上与酵母的RPD3/ HDA1 蛋白表现出极大的相似性；一类是与 NAD+有关的酵母SIR2 的同源蛋白，主要包括SIRT 7 。

9、个SIRT 家族成员。在植物中还存在一类植物特有的去乙酰化酶家族HD家族，该家族并未在酵母或者动物体内发现。这些基因分别定位于细胞核、细胞质、线粒体及其他细胞器，负责组蛋白及非组蛋白的乙酰化修饰，从而参与植物的生长、发育、抗逆等各个方面的调控。如拟南芥HDA6参与DNA甲基化的维持和光信号途径，HDA7参与种子萌发、植物生长、雌配子体发育与胚胎形成各个方面。 0005 番茄HDA3基因属于RPD3/ HDA1家族，定位于番茄细胞核。到目前为止，关于该基因的研究不多，有报道该基因为番茄果实成熟和类胡萝卜素累积的负调因子，但是有关该基因在植物抗病过程中。

10、的作用没有任何报道。因此，克隆和解析调控番茄抗病的新基因，对进一步了解和完善番茄抗病，并为利用转基因方法进行分子育种、新品种的培育奠定良好的理论和应用基础。发明内容 0006 本发明提供了一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到HDA3基因，构建了HDA3基因过表达载体pK7FW2-HDA3并利用农杆菌介导的转基因方法构建了转基因植株，并且证实了HDA3基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力。 0007 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：说明书 1/4 页 3 CN 111500626 A 3 本发明提供了。

11、一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，所述HDA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0008 进一步的，所述应用包括以下步骤：（1）构建HDA3基因过表达载体：根据HDA3基因的CDS序列设计引物后，进行PCR扩增；扩增产物纯化后，回收酶切产物与pQB质粒进行连接，得到HDA3基因入门载体pQB-HDA3；通过 Gateway方法获得目的载体pK7FW2-HDA3。 0009 （2）构建HDA3基因过表达重组菌株：将所述HDA3基因过表达载体转化至农杆菌中，得到HDA3基因过表达重组菌株；（3）构建HDA3基因过表达植株：将所述HD。

12、A3基因过表达重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，并培养至得到再生植物，即得到HDA3基因过表达株系。 0010 进一步的，所述步骤（1）中引物的序列为 HDA3 -F： 5 - ATGGACTCCT CCACCGTAGA CG -3 ； HDA3 -R： 5 - GGAGATAATA TCAGTTGGTT GATC -3 。 0011 进一步的，所述质粒为pK7FW2。 0012 进一步的，所述基因过表达重组载体为pK7FW2-HDA3。 0013 进一步的，所述农杆菌为LBA4404。 0014 进一步的，所述步骤（3）中培养的条。

13、件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。 0015 进一步的，所述HDA3基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。 0016 进一步的，番茄HDA3基因敲除株系过表达植株与野生型植株相比，叶片上的灰霉量明显降低。 0017 进一步的，所述植物为番茄。 0018 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：本发明从番茄中分离和克隆到HDA3 基因，并进一步将HDA3基因连接到入门载体pQB上，之后通过Gateway方法获得HDA3基因过表达重组载体pK7FW2-HDA3，再利用农杆菌得到过表达重组菌株LBA4404-pK7FW2-HDA3，并侵。

14、染转化番茄子叶，得到HDA3基因过表达植株，通过研究过表达植株的表型，并将其与相同条件下生长的野生型番茄的叶子上的病斑进行比较。本发明通过实验分析首次证明了HDA3 基因具有调控番茄对灰霉病抗病性的功能，而过表达HDA3基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力；HDA3基因过表达植株叶子上的病斑明显减小，灰霉量也明显低于野生型番茄株系。本发明的技术方案对HDA3基因在提高番茄对灰霉病的抗病性上具有应用价值，同时也为利用HDA3基因培育抗病、高产的番茄品种奠定良好的理论和应用基础。附图说明 0019 图1为HDA3基因的PCR扩增及电泳检测结果，其中M为DNA ma。

15、rker， 1-5为HDA3 PCR 产物。 0020 图2为pK7FW2-HDA3载体构建结果，其中M为DNA marker， 1-6为菌落PCR筛选。 0021 图3为HDA3的亚细胞定位结果。 0022 图4A为HDA3基因过表达植株的抗病性变化结果。说明书 2/4 页 4 CN 111500626 A 4 0023 图4B为HDA3基因过表达植株中叶片上病斑直径的结果，（*p0.01）。 0024 图5为HDA3基因过表达植株叶片中的灰霉量的结果，（*p0.01）。具体实施方式 0025 以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。 0026 下述实施例中的。

16、实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。下述实施例中所述的PQB载体和pK7FW2载体均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 0027 实施例1：番茄HDA3基因的序列分析、克隆及载体构建 1、本发明从GeneBank数据库中获得番茄HDA3基因，分析表明HDA3基全长1800bp （序列如SEQ ID NO.1所示），属于RPD3/ HDA1家族，其CDS序列为1416bp （序列如SEQ ID NO.2所示，编码含有471个氨基酸的蛋白质（序列如。

17、SEQ ID NO.3所示），根据番茄HDA3基因的CDS序列设计特异性引物，引物序列如下： HDA3 -F： 5 - ATGGACTCCT CCACCGTAGA CG -3 （SEQ ID NO.4）； HDA3 -R： 5 - GGAGATAATA TCAGTTGGTT GATC -3 （SEQ ID NO.5）。 0028 使用TRI Reagent提取番茄的总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录后得到cDNA 链，之后以其作为模板，使用上述特异性引物对获得的cDNA进行高保真酶扩增（图1），再将获得的扩增产物进行回收、纯化后克隆到PQB载体上，获得PQB-HD。

18、A3重组质粒，送至生物公司测序确认序列。 0029 2、测序正确的质粒通过Gateway方法与带有绿色荧光蛋白标签的pK7FW2载体融合，构建pK7FW2-HDA3载体。之后PCR筛选验证（图2）。 0030 实施例2：番茄HDA3过表达植株的构建 1、番茄HDA3过表达植株的获得将所述pK7FW2-HDA3转入LBA4404农杆菌感受态中，通过农杆菌注射渗透法转化番茄子叶。再利用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，同时设置转空载体作为对照；每2-3周更换培养基直到得到再生苗，其中培养条件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。 0031 分别提取。

19、再生苗的基因组DNA，用HDA3特异性引物HDA3-F和HDA3-R进行PCR扩增，筛选能扩增到特异性片段的植株。取PCR阳性的植株叶片，撕取下表皮，于在激光共聚焦电子显微镜下观察HDA3的亚细胞定位。结果如图1所示， HDA3定位于番茄的细胞核。得到的阳性苗移栽大盆待开花结果以留种。本发明得到3个HDA3过表达阳性植株，并分别标记为 HDA3-GFP-7、HDA3-GFP-12和HDA3-GFP-13。 0032 实施例3：阳性番茄HDA3基因过表达植株表型的鉴定 1、将HDA3基因过表达植株HDA3-GFP-7、HDA3-GFP-12和HDA3-GFP-13与野生。

20、型番茄（WT）的种子分别播种于营养土中，培养于温室中，其中培养条件为16h光照（26） /8h黑暗（18 ）。然后，选取4周左右、大小长势相同的HDA3基因过表达植株与野生型各3组，每组含3棵番茄植株，从培养好的平皿上打菌饼接种番茄叶片，将叶片置于塑料盒中，上面敷上一层保鲜膜以保持百分百湿度，在22下保持24-48小时后观察番茄叶片发病情况并进行数据统计。结果如图4A和4B所示，与野生型相比，HDA3基因过表达植株叶子上的病斑直径明显减小。说明书 3/4 页 5 CN 111500626 A 5 0033 2、对灰霉菌侵染后的番茄叶片提取总RNA，。

21、用qRT-PCR检测叶片中的灰霉量，并使用番茄Actin做内参，所用引物序列如下： -Tubulin-F： 5 -ACCGTTCCAGAGTTGACTCAA-3 （SEQ ID NO.6） -Tubulin-R： 5 -GCAAGAAAGCCTTTCTTCTGA-3 （SEQ ID NO.7）结果如图5所示，HDA3基因过表达纯合株系中的灰霉量明显低于野生型番茄。 0034 以上证据表明HDA3基因对番茄抵抗灰霉菌侵染有重要作用，且过表达HDA3基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，因此番茄HDA3基因具有调控番茄抵抗灰霉菌侵染的功能。 0035 以上实施例仅用以说明本发。

22、明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。说明书 4/4 页 6 CN 111500626 A 6 序列表青岛农业大学一种HDA3基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用 7 SIPOSequenceListing 1.0 1 1800 DNA 番茄(Solanum lycopersicum) 1 ggactcaata cagactgccg a。

23、gtctctcgc aaaaatccca aatttcattt tcactctcac 60 tccgaaccca aaaatcagtg gctaatggac tcctccaccg tagacggcgg cgcatcgctt 120 ccatcaaccg gaaccgacgc taggaagcgt cgtgtctctt acttctatga gccaaccatc 180 ggcgattatt actacggcca aggtcatccg atgaagccgc accgtatcag aatggcccac 240 aatctcatcg taaactacta cctacacagg cgtatggaaa 。

24、tcagtcgtcc ttttccggcg 300 ggagaggatg atatccgacg ttttcactcg ccggattatg ttgacttcct tgctaccgtt 360 tcaccggaga ctcttcatga ccatacacat tcacgtcatc tcaaacggtt taatgttggt 420 gaggattgtc ctgttttcga tgggcttttt gggttttgtc aagcttctgc tggtggatct 480 attggggctg cggttaagct taatcggcag gatgctgata taacgatcaa ctgggctgg。

25、t 540 ggtctgcacc atgcaaagaa aagtgaagct tctggttttt gctatgtgaa tgatattgtt 600 cttggtattc ttgagctcct caaagtccac aagcgtgtat tgtacataga cattgatatt 660 caccatggtg atggtgttga ggaggctttt ttcaccacag atagagtcat gacagtatct 720 tttcataagt ttggggattt ctttcctggt acggggcaca tcaaagacat tggtgcaaat 780 caggggaagt act。

26、atgccct aaatgtccca ttgcatgatg ggatggatga cgatagtttt 840 ggtagactat ttcgtcccac aatacaaaaa gtcatggagg tctaccaacc tgaggctgtt 900 gttcttcaat gtggggctga ttcactggct ggagacaggt tgggttgctt caacttgtct 960 gtcaagggcc atgccgcttg ccttaggtac ctcagatcct tcaatgtccc tctgatggta 1020 ttgggtggtg gaggttatac tataagaaat 。

27、gtcgctaggt gctggtgcta tgagacagca 1080 gttgcagttg gggtagaacc tgaaaacaag ttgccttaca acgagtatta tgaatatttt 1140 ggcccagatt atactcttca tgttgaacca attcccatgg agaatctaaa ttcacctagg 1200 gatctggaga agatgaggaa catattgctt gagcaaatct ctcagttgcc tcatgcacct 1260 agtgtgccat ttcagaccac tccttctaca acagaagtcc cagag。

28、gagaa agaggaaaat 1320 atggatcgaa ggcctaaacc acggatatgg aatggtgatg gttatgagtc tgatgctgat 1380 gaagacgaga aacctagaca gcgaagttca gatagtaatc ttactccagt ggaatcatct 1440 gacatgaggg atgtggacga ccaagccaat gcagatgaca tggttgatga tcatccctag 1500 ttcaaagctc ttctacatcg tctcaaaatg caatgactga tactattttt gggtcggaag。

29、 1560 taacaagcct tgctatttga cctttcgcct ctcatgagca attgttttga tgtctctttt 1620 gctgaaaatg gaactagaaa aatgagttgt tatagtagat tgtagttagt tggatatagg 1680 序列表 1/5 页 7 CN 111500626 A 7 ctagtgattg atgaatgaga gcacaatgct gtctctcgta aatggaccgg tgcaccacaa 1740 agtagacttt gttcttatgg atactgctta ttacatacaa atattatc。

30、ag tgttctgcaa 1800 2 1416 DNA 番茄(Solanum lycopersicum) 2 atggactcct ccaccgtaga cggcggcgca tcgcttccat caaccggaac cgacgctagg 60 aagcgtcgtg tctcttactt ctatgagcca accatcggcg attattacta cggccaaggt 120 catccgatga agccgcaccg tatcagaatg gcccacaatc tcatcgtaaa ctactaccta 180 cacaggcgta tggaaatcag tcgtcctttt c。

31、cggcgggag aggatgatat ccgacgtttt 240 cactcgccgg attatgttga cttccttgct accgtttcac cggagactct tcatgaccat 300 acacattcac gtcatctcaa acggtttaat gttggtgagg attgtcctgt tttcgatggg 360 ctttttgggt tttgtcaagc ttctgctggt ggatctattg gggctgcggt taagcttaat 420 cggcaggatg ctgatataac gatcaactgg gctggtggtc tgcaccatgc。

32、 aaagaaaagt 480 gaagcttctg gtttttgcta tgtgaatgat attgttcttg gtattcttga gctcctcaaa 540 gtccacaagc gtgtattgta catagacatt gatattcacc atggtgatgg tgttgaggag 600 gcttttttca ccacagatag agtcatgaca gtatcttttc ataagtttgg ggatttcttt 660 cctggtacgg ggcacatcaa agacattggt gcaaatcagg ggaagtacta tgccctaaat 720 gtcc。

33、cattgc atgatgggat ggatgacgat agttttggta gactatttcg tcccacaata 780 caaaaagtca tggaggtcta ccaacctgag gctgttgttc ttcaatgtgg ggctgattca 840 ctggctggag acaggttggg ttgcttcaac ttgtctgtca agggccatgc cgcttgcctt 900 aggtacctca gatccttcaa tgtccctctg atggtattgg gtggtggagg ttatactata 960 agaaatgtcg ctaggtgctg gt。

34、gctatgag acagcagttg cagttggggt agaacctgaa 1020 aacaagttgc cttacaacga gtattatgaa tattttggcc cagattatac tcttcatgtt 1080 gaaccaattc ccatggagaa tctaaattca cctagggatc tggagaagat gaggaacata 1140 ttgcttgagc aaatctctca gttgcctcat gcacctagtg tgccatttca gaccactcct 1200 tctacaacag aagtcccaga ggagaaagag gaaaata。

35、tgg atcgaaggcc taaaccacgg 1260 atatggaatg gtgatggtta tgagtctgat gctgatgaag acgagaaacc tagacagcga 1320 agttcagata gtaatcttac tccagtggaa tcatctgaca tgagggatgt ggacgaccaa 1380 gccaatgcag atgacatggt tgatgatcat ccctag 1416 3 471 PRT 番茄(Solanum lycopersicum) 3 Met Asp Ser Ser Thr Val Asp Gly Gly Ala Ser L。

36、eu Pro Ser Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asp Ala Arg Lys Arg Arg Val Ser Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Ile 序列表 2/5 页 8 CN 111500626 A 8 20 25 30 Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Ile 35 40 45 Arg Met Ala His Asn Leu Ile Val Asn Tyr Tyr Leu His Arg Arg Met 50 55 60 Glu Ile Ser Arg Pro Phe。

37、 Pro Ala Gly Glu Asp Asp Ile Arg Arg Phe 65 70 75 80 His Ser Pro Asp Tyr Val Asp Phe Leu Ala Thr Val Ser Pro Glu Thr 85 90 95 Leu His Asp His Thr His Ser Arg His Leu Lys Arg Phe Asn Val Gly 100 105 110 Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Phe Gly Phe Cys Gln Ala Ser 115 120 125 Ala Gly Gly Ser Ile Gl。

38、y Ala Ala Val Lys Leu Asn Arg Gln Asp Ala 130 135 140 Asp Ile Thr Ile Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys Ser 145 150 155 160 Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile Leu 165 170 175 Glu Leu Leu Lys Val His Lys Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile 180 185 190 His His Gly As。

39、p Gly Val Glu Glu Ala Phe Phe Thr Thr Asp Arg Val 195 200 205 Met Thr Val Ser Phe His Lys Phe Gly Asp Phe Phe Pro Gly Thr Gly 210 215 220 His Ile Lys Asp Ile Gly Ala Asn Gln Gly Lys Tyr Tyr Ala Leu Asn 225 230 235 240 Val Pro Leu His Asp Gly Met Asp Asp Asp Ser Phe Gly Arg Leu Phe 245 250 255 Arg Pr。

40、o Thr Ile Gln Lys Val Met Glu Val Tyr Gln Pro Glu Ala Val 260 265 270 Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Ala Gly Asp Arg Leu Gly Cys 275 280 285 Phe Asn Leu Ser Val Lys Gly His Ala Ala Cys Leu Arg Tyr Leu Arg 290 295 300 Ser Phe Asn Val Pro Leu Met Val Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Ile 305 310 315 32。

41、0 Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Cys Tyr Glu Thr Ala Val Ala Val Gly 325 330 335 序列表 3/5 页 9 CN 111500626 A 9 Val Glu Pro Glu Asn Lys Leu Pro Tyr Asn Glu Tyr Tyr Glu Tyr Phe 340 345 350 Gly Pro Asp Tyr Thr Leu His Val Glu Pro Ile Pro Met Glu Asn Leu 355 360 365 Asn Ser Pro Arg Asp Leu Glu Lys Met Arg A。

42、sn Ile Leu Leu Glu Gln 370 375 380 Ile Ser Gln Leu Pro His Ala Pro Ser Val Pro Phe Gln Thr Thr Pro 385 390 395 400 Ser Thr Thr Glu Val Pro Glu Glu Lys Glu Glu Asn Met Asp Arg Arg 405 410 415 Pro Lys Pro Arg Ile Trp Asn Gly Asp Gly Tyr Glu Ser Asp Ala Asp 420 425 430 Glu Asp Glu Lys Pro Arg Gln Arg S。

43、er Ser Asp Ser Asn Leu Thr Pro 435 440 445 Val Glu Ser Ser Asp Met Arg Asp Val Asp Asp Gln Ala Asn Ala Asp 450 455 460 Asp Met Val Asp Asp His Pro 465 470 4 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 atggactcct ccaccgtaga cg 22 5 24 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 ggagataata tcagttggtt gatc 24 6 21 DNA 人工序列。

44、(Artificial Sequence) 6 accgttccag agttgactca a 21 7 21 DNA 序列表 4/5 页 10 CN 111500626 A 10 人工序列(Artificial Sequence) 7 gcaagaaagc ctttcttctg a 21 序列表 5/5 页 11 CN 111500626 A 11 图1 图2 说明书附图 1/4 页 12 CN 111500626 A 12 图3 说明书附图 2/4 页 13 CN 111500626 A 13 图4A 图4B 说明书附图 3/4 页 14 CN 111500626 A 14 图5 说明书附图 4/4 页 15 CN 111500626 A 15 。