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萱草修复石油烃污染土壤的根际机制和根系代谢组学分析

花匠小妙招
2024-11-10 05:28

摘要: 采用温室盆栽方法,研究花卉植物萱草(Hemerocallis middendorfii Trautv.et Mey.)对大港油田石油烃污染土壤的修复,设定的土壤石油烃污染含量为: 0、10000和40000 mg·kg-1.结果表明,萱草对石油烃含量≤40000 mg·kg-1具有良好的耐性,并且萱草对石油烃污染土壤中石油烃的修复效果比较显著,主要表现在试验组石油烃的去除率分别为53.7%和33.4%,显著高于空白对照组(31.8%和12.0%).通过GC-MS测定土壤中的氨基酸、有机酸以及糖类等成分的相对含量,并结合PCA和PLS-DA模型探讨了土壤石油烃去除的根际机制.结果发现,萱草的种植确实改变了土壤各成分的分布特征,而且其中喃葡萄糖对石油烃的去除起到关键的作用.此外,对萱草根系代谢组学的分析结果显示,仅在污染组发现了特殊的代谢物丙氨酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和亚油酸.而且,石油烃的暴露确实改变了萱草根系的初生代谢流,引起了一些代谢物的显著变化.总之,萱草可以种植于石油烃含量≤40000 mg·kg-1的污染土壤,并具备了对石油烃的修复能力; 同时石油烃的暴露改变了萱草的根系代谢,而这种改变可能是萱草对石油烃污染土壤做出的代谢响应.

Rhizospheric Mechanisms of Hemerocallis middendorfii Trautv. et Mey. Remediating Petroleum-contaminated Soil and Metabonomic Analyses of the Root Systems

Abstract: The effects of a special ornamental plant Hemerocallis middendorfii Trautv. et Mey. on remediating petroleum-contaminated soil from the Dagang Oilfield in Tianjin, China, was studied by a greenhouse pot-culture experiment and the gradients of TPHs were 0, 10000 and 40000 mg·kg-1. The results suggested that H. middendorfii had a high tolerance to TPHs(≤40000 mg·kg-1). And H. middendorfii significantly(P<0.05)promoted the removal rate of TPHs (53.7% and 33.4%) compared with corresponding controls (31.8% and 12.0%) by natural degradation, respectively. The relative abundance of amino acids, organic acids and sugars and others in soil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and PCA and PLS-DA models were to investigate the rhizospheric mechanisms. The results suggested that H. middendorfii changed the distribution characteristics of each component in soil, and the glucopyranoside played a key role in the removal of TPHs. Furthermore, the results about comparative metabolic profile showed that some special metabolites were only found in the contaminated groups, including alanine, tetradecanoic acid, hexadecanoic acid and 9,12-octadecadienoic acid. Additionally, the exposure of TPHs changed the primary metabolic flux of roots, and caused the significant (P<0.01)change of metabolites. In conclusion, H. middendorfii might be an enduring ornamental plant for effective remediating TPHs (≤40000 mg·kg-1) in soil. But the exposure of TPHs had changed the metabolic profile of H. middendorfii in roots, which might be the metabolic response of H. middendorfii to petroleum-contaminated soil.

Key words:total petroleum hydrocarbons (TPHs) contaminated soil Hemerocallis middendorfii Trautv. et Mey. rhizospheric mechanism root metabonomic analyses

土壤的石油烃(total petroleum hydrocarbons,TPHs)污染是世界性的环境问题之一[1]. TPHs属于混合物，主要包括烷烃、芳香烃，以及难降解的沥青质和极性组分[2]，对许多组织器官有生物毒性，特别是其中的一些芳香烃组分，不仅具有强烈的致癌、致畸和致突变毒性,还能通过食物链在动植物体内逐级富集和放大,对人体健康造成严重的威胁[3]. 在TPHs污染土壤修复技术中，植物修复是目前最具潜力的修复技术，概括来说，就是利用植物及其根际圈微生物体系的吸收、挥发和转化、降解等作用机制来清除污染环境中的污染物质[4]. 植物修复以其操作相对简单,经济和技术上能够大面积实施等优点，几乎成为污染程度较轻且污染面积巨大土壤修复的不可替代技术[5]. 野生花卉作为一种新的TPHs污染土壤的植物修复品种，除了具有一般植物修复的优势外，还具有很多优点，例如它可以在去除TPHs的同时，美化周围的环境；同时可以尽量避免一些污染物进入食物链，减少对人类的危害. 在以往的研究中，周启星等率先从30种花卉植物中筛选出了3种对石油烃污染具有强耐受力且能促进TPHs降解的野生花卉植物，分别为：紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)、凤仙花(Impatiens balsamina L.)和牵牛花(Pharbitis nil L.)[2, 6, 7].

植物在生长过程中，在根系附近会形成一个特殊的生态修复圈层，即根际区[8]. 由于根际区特殊的物理、化学和生物属性，许多污染物在根际比在非根际区去除得更加迅速和完全[9, 10]. 根际分泌物是根际区石油烃去除的重要驱动者[11]，是根际修复的一个重要机制. 良好的植物根系分部网可以作为一种天然的注射系统，将植物化学物(phytochemicals)以根系分泌物的形式释放到根际区[12]，例如低分子的有机酸，氨基酸、糖类等以及其它的大分子有机化合物[13]，可以为根际微生物的生长和长期生存提供碳源和能源，或增加污染物和营养元素的生物有效性，以及作为TPHs的共代谢物[11, 14, 15, 16]，促进土壤TPHs的去除.

最近，“组学”技术，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学，已被认为是一种检测化学诱导对生物产生影响的一种更加全面的方法[17]. 其中代谢组学是研究生物系统科学的一个重要分支，它是生物系统对内源性和外源性因素做出的整体性的响应[18, 19]. 目前，代谢组学分析已经在哺乳动物和植物的应激响应的研究中得到成功应用，并成为植物病理生理学研究的有力工具[20].

试验通过温室盆栽试验研究了野生花卉萱草对大港油田TPHs(≤40 000 mg ·kg-1)污染土壤的修复. 萱草属于百合科萱草属多年生草本植物，耐寒性强，耐光线充足，又耐半荫，对土壤要求不严，适应多种土壤环境，无论盐碱地、砂石地、贫瘠荒地，均可生长良好. 试验通过对萱草鲜重、根长和株高，土壤氨基酸、有机酸、糖类等成分以及萱草根系代谢物的测定，研究萱草对污染的耐性和TPHs的降解能力；不同处理组，土壤中有机酸、氨基酸、糖类等组分的分布特征；TPHs的暴露对萱草根系代谢组学的影响，旨在探讨萱草修复TPHs污染土壤的可行性、根际修复机制以及TPHs暴露下萱草根系代谢的响应. 本研究结果对今后开展TPHs污染土壤植物修复研究及TPHs污染暴露下代谢组学研究具有一定借鉴意义.

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试植物：萱草(Hemerocallis middendorfii Trautv. et Mey.)购买自北京绿普方圆花卉有限公司.

供试土壤：TPHs污染土采自大港油田第一采油厂，清洁土取自天津市滨海新区森林公园. 设定的TPHs污染含量为：0、 10 000和40 000 mg ·kg-1. 将风干的TPHs污染土过10目筛子，测定其含量为61 675 mg ·kg-1，用清洁土将其稀释，并混合均匀. 稀释后得到实际TPHs污染含量为：0、 11 829和39 971 mg ·kg-1，土壤pH 7.65-8.32，含盐量0.3%-5.3%.

1.2 盆栽试验设计

盆栽试验位于天津南开大学泰达学院温室内，温室温度控制在18-25℃，每天保持光照16 h，黑暗8 h.

按照每盆装土1.5 kg的标准，将已经混好的TPHs污染土装入花盆(直径230 mm，高180 mm)，每个浓度设3 个平行，同时准备不种植植物的空白对照组，共18盆，浇水平衡2 周后待用.

盆栽试验采用栽种的方式进行. 选取长势相近的萱草，用自来水清洗其根部，然后种植于平衡好的土壤中，每盆1棵，试验期间每天浇适量的水，空白对照组与试验组处理一致.

1.3 石油烃(TPHs)的测定

土壤TPHs的测定方法参考索氏提取方法(US EPA 3550c)，具体方法参考文献[21].

1.4 植物生物量的测定

为了更好地评价萱草对TPHs的耐性，种植5个月后，将其收获，具体操作如下，将萱草先用自来水冲洗干净表面，再用去离子水充分洗净萱草植株，然后用滤纸擦干表面的水分，最后用剪刀将植株的根部与地上部分开，测量其鲜重、根长和株高.

1.5 萱草根系代谢组学分析

萱草根系代谢组学采用GC-MS进行分析，具体方法参考文献[22].

1.6 土壤氨基酸、有机酸及糖类等成分的测定

关于土壤有机酸、氨基酸及糖类等成分的测定参照代谢组学的研究方法[22]，并做一定的改变，具体操作如下：将土壤样品冷冻干燥48 h，过100目筛，称取100 mg放入10 mL的离心管；样品中加入4.5 mL提前保存于-20℃的提取混合溶液1[甲醇-氯仿-水 2.5 ∶1 ∶1(体积比)]；加入50 μL的核糖醇(0.2 mg ·mL-1)，作为水相的内标；在40℃下，微波萃取20 min，然后于8 000 r ·min-1，4℃离心10 min. 将上清液转移到干净的10 mL离心管中. 底部沉淀中加入2 mL保存于-20℃的溶液2[甲醇-氯仿1 ∶1(体积比)]. 于40℃下，微波萃取20 min，然后8 000 r ·min-1，4℃离心10 min. 收集第二次上清液，并与第一次收集的上清液混合. 加入1 mL超纯水，过0.22 μm的有机相滤膜，然后8 000 r ·min-1，4℃离心5 min. 离心后，上层溶液是甲醇/水相约5 mL，下层为氯仿相约1 mL. 用氮气吹干氯仿相，而甲醇/水相冷冻干燥16 h，取出. 需要注意的是：样品衍生化后，需在24 h内上样，如若不上样，可将冷冻干燥后的样品封口后放于-80℃冰箱中保存. 采用两步法进行衍生化：首先加入50 μL用吡啶(pyridine)溶解的甲氧氨基盐酸盐(o-methyl amine hydrochloride)20 mg ·mL-1，密封，涡旋1 min，8 000 r ·min-1，4℃离心3 min，于30℃水浴90 min；然后加入80 μL硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA)，37℃水浴30 min；最后将衍生化好的样品转移到适合GC-MS分析的内衬管中，待测.

气相色谱进样参数：进样量1 μL，进样口温度230℃，不分流进样模式，载气为氦气，流速2 mL ·min-1，使用自动进样器进样. 气相色谱参数：MDN-35毛细管色谱柱(30 m)，温度程序为80℃恒温2 min，然后以15℃ ·min-1的速率升温到330℃，然后持续6 min. 传输线(transfer line)温度设定为250℃. 质谱参数：离子源温度设定为250℃，质量扫描范围是m/z 70-600，采集速率每秒20个扫描，质谱电子轰击源灯丝开启时间在色谱溶剂延迟170 s后，检测器电压2 100 V.

1.7 统计分析

数据统计与分析采用SPSS 20.0与Origin 9.0进行. 按单因素方差分析(ANOVA)方法中LDS进行多样本间的显著性检验(P＜0.05). 软件SIMCA-P11.5进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA). MeV4.9.0软件绘制代谢物热图，并通过分层聚类(hierarchical clustering,HCL)进行计算，相关参数距离和联系方法选择默认选项分别为Pearson correlation和The average linkage clustering. 使用软件Venny 2.0.2制作Venn图.

2 结果与讨论 2.1 萱草对石油烃(TPHs)的耐性

植物种植5个月后，将其收获. 由图 1(a)可以看出，不同TPHs污染浓度下的萱草从外表看生长状况良好，无叶片发黄落叶枯萎等明显的毒害症状，说明萱草对TPHs污染土壤具备一定的耐性. 另外，由图 1(b) 可知，与空白对照组相比，无论从鲜重还是株高和根长上看，TPHs(≤40 000 mg ·kg-1)的存在对萱草的生长并没有明显(P＜0.05)的抑制作用. 植物的根部是比地上部更为重要的耐性指标，仅从根的鲜重来看，污染组根的鲜重没有受到明显的抑制. 然而萱草在TPHs污染状态下的根长明显高于空白对照组. 这说明TPHs的暴露对萱草的根系生长影响不大，甚至有促进作用. 不同TPHs浓度处理下萱草的生长相对于空包对照组无明显降低，并且在一定浓度下有所增加，这对于其发挥修复作用极为有利，虽然其在TPHs胁迫下的耐性机制有待于进一步研究，但萱草显然对于TPHs污染具备一定耐性. 因而，对萱草修复TPHs污染土壤的探讨，将为TPHs污染胁迫下污染土壤的植物修复提供新的思路.

CK，萱草，空白；1%，萱草，TPHs 10 000 mg ·kg-1；4%，萱草，TPHs 40 000 mg ·kg-1；数据由平均值±标准差组成；误差棒代表标准偏差; 标注不同的小写和大写英文字母分别是不同TPHs处理下，高度和鲜重差异显著性分析(P＜0.05) 图 1 不同TPHs污染浓度下，萱草收获时的图片及株高、根长和鲜重比较 Fig. 1 A set of pictures during harvesting H. middendorfii, length of root and shoot and the fresh weight of root and shoot of H. middendorfii at different TPHs contamination levels

2.2 石油烃(TPHs)的去除和根际机制

由图 2可以看出，与空白对照相比，萱草显著地促进了土壤TPHs的去除. 主要表现在试验组TPHs的去除率分别为53.7%和33.4%，而对应空白对照组仅为31.8%和12.0%. 而且在TPHs浓度10 000 mg ·kg-1和 40 000 mg ·kg-1的浓度下，试验组去除率分别是空白对照组的1.69和2.78倍. 这说明萱草具有修复TPHs污染土壤的能力. 类似地，一些研究人员也发现一些植物，可用于高浓度TPHs污染土壤中TPHs的去除，例如短叶茳芏(Cyperus brevifolius (Rottb.) Hassk)、玉米草(Zea mexicana)、披碱草(Elymus dahuricum)和紫花苜宿(Medicago sativa L.)[23, 24, 25]，均可用于修复大于60 000 mg ·kg-1石油烃污染土壤.

数据由平均值±标准差组成，误差棒代表标准偏差；所有均值用%(质量浓度)表示；标注不同英文字母是不同 TPHs处理下，差异显著性分析(P＜0.05) 图 2 种植萱草试验组与空白对照组对不同浓度TPHs污染土壤的去除率 Fig. 2 Removal rates of TPHs in contaminated soil with different pollutant concentrations planted with or without H. middendorfii

主成分分析(principal component analysis,PCA)是一个比较好的用于评价多变量样本间差别的工具[26]. 对土壤样品中46种检测出的氨基酸、有机酸及糖类等成分的量化数据进行PCA计算，以确定土壤样品间的差异性. 图 3是在组分1(占总变量的53.8%)的基础上进行的计算，结果显示种植萱草土壤与空白土壤明显的分开了，尤其是萱草TPHs浓度10 000 mg ·kg-1和40 000 mg ·kg-1明显区别于其它样本. 偏最小二乘法判别分析(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)可以从多因素中解析出主要影响因素[22]. 图 4是用土壤氨基酸、有机酸和糖类等成分对土壤TPHs去除率的计算结果，其中组分1(占总变量的72.1%)结果显示不同土壤样本间较好地分开了，并且土壤样本的分布特征与TPHs的降解率一致，因此组分1可以较好地解释土壤TPHs的去除.

XCK:萱草，空白； X1%: 萱草，TPHs 10 000 mg ·kg-1；X4%: 萱草，TPHs 40 000 mg ·kg-1；CCK: 未种植，空白； CK1%: 未种植，TPHs 10 000 mg ·kg-1；CK4%: 未种植，TPHs 40 000 mg ·kg-1 图 3 在PCA模型下，对土壤氨基酸、有机酸及类等成分进行聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of amino acid,organic acid, carbohydrate and others in soil using PCA scores plot

土壤氨基酸、有机酸及糖类等成分用于分析TPHs的去除率；X1%: 萱草，TPHs 10 000 mg ·kg-1；X4%: 萱草，TPHs 40 000 mg ·kg-1. CK1%: 未种植，TPHs 10 000 mg ·kg-1；CK4%: 未种植，TPHs 40 000 mg ·kg-1 图 4 在PLS-DA模型下，对土壤氨基酸、有机酸及类等成分进行聚类分析 Fig. 4 Cluster analysis of amino acid,organic acid, carbohydrate and others in soil using PLS-DA scores plot

为了进一步分析土壤各成分对TPHs去除起到主要作用的贡献者，需要对VIP(Variable importance in the projection)值进行计算. 因为当VIP＞1时，变量对模型具有显著的统计学意义[26]. 分析土壤各成分的VIP值(图 5)，发现其中喃葡萄糖的VIP值最大为1.38，其次是丁酸、果糖、己二酸、核糖、葡萄糖酸、赖氨酸(VIP值＞1.20)，在土壤TPHs去除中起到实质性的作用. 而且试验过程中发现与空白对照组土壤相比，仅在种植萱草的土壤中检测到14种特殊的成分(图 5和图 6)，其中氨基酸类有丝氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，有机酸类有乳酸、癸酸、亚油酸、苹果酸和戊二酸，糖类和糖酸类有核糖、半乳糖、麦芽糖、来苏糖、吡喃葡萄糖和葡萄糖酸. 另外，种植萱草土壤各成分与检测到的萱草根系代谢物有36种共有组分(图 6).

土壤氨基酸、有机酸及糖类等成分用于分析TPHs的去除率；“★”代表种植萱草土壤可以检测到，而空白对照组不能检测到的成分图 5 PLS-DA模型处理后的土壤氨基酸、有机酸及糖类等成分的VIP值 Fig. 5 Variable important projection (VIP)of amino acid,organic acid,carbohydrate and others in soil using PLS-DA model

图 6 Venn图展现未种植萱草土壤成分、种植萱草土壤成分、染组萱草代谢物和空白组萱草代谢物的种类数 Fig. 6 Venn diagram showing the number of components of soil with or without H. middendorfii,and root metabolites of H. middendorfii in control and contaminated groups

研究发现植物根系可以将5%-21%的植物光合产物，例如有机酸、氨基酸、糖类等释放到根际周围[27]，一方面它们可以作为根际微生物碳源和能源，或作为共代谢物[12]，增加微生物的数量和代谢活性，另一方面，也可以作为表面活性剂，增加TPHs的生物有效性[14, 15]. 试验过程中在土壤中检测到的成分主要包括氨基酸、有机酸和糖类，这些成分多是植物光和作用的产物，属于植物代谢物，而且植物体内的含量远大于土壤，所以极有可能是萱草以根系分泌物的形式将代谢物经根部释放到了根际区，进而促进了土壤TPHs的去除，这是一个重要的TPHs根际修复机制. 由于土壤组成的复杂性，只能观察到修复后样本各成分含量和种类的整体变化，无法确认哪些成分来自植物根系分泌. 未来工作可以集中在利用稳定同位素探针技术，在13 C标记的空气环境下进行试验，确定植物修复过程中活跃的根系分泌物种类和对土壤TPHs去除的主要贡献者.

2.3 萱草根系代谢组学分析

萱草根系代谢物经过GC-MS分析后，共得到57种代谢物. 大部分的代谢物是在初生代谢途径中产生的，包括氨基酸、有机酸、糖类、糖醇和糖酸以及其它组分. 图 7是对萱草根系代谢物进行的分层聚类(hierarchical cluster,HCL)分析，结果显示TPHs的暴露，使得根系代谢发生了不同程度的变化. 萱草空白组和TPHs含量10 000 mg ·kg-1先聚在了一起，然后再与高含量40 000 mg ·kg-1聚在一起. 这说明TPHs的存在改变了萱草的根系代谢，同时低含量TPHs对代谢的改变较小，而高含量TPHs引起的改变较大.

热图代表不同处理间代谢物的相对含量；XCK：萱草，空白； X1%：萱草，TPHs 10 000 mg ·kg-1； X4%：萱草，TPHs 40 000 mg ·kg-1 图 7 在不同含量TPHs暴露下，使用HCL模型对草根系代谢物进行的代谢分析 Fig. 7 Metabolic analysis in roots of H. middendorfii using HCL model under different concentrations of TPHs exposure

图 8是根据萱草根系代谢物绘制的初生代谢流[28]. 与空白组相比，TPHs的存在显著地(P＜0.01)增加了萱草根系中来苏糖、果糖、硬脂酸和柠檬酸的含量，而减少了甘氨酸、肌糖、戊二酸、木糖、丙二酸、珠光脂酸和脯氨酸的含量. 同时与空白和低含量TPHs(10 000 mg ·kg-1)相比，高含量TPHs(40 000 mg ·kg-1)的暴露显著地(P＜0.01)增加了乳酸、草酸、山梨醇和苹果酸的含量，却减少了癸酸和麦芽糖的含量. 类似地，Zhang等[29]发现城市污水的暴露会显著地改变小鼠血清中的2-氧化戊二酸和乳酸，以及尿液中的乙酸、柠檬酸和延胡索酸的含量. 试验仅在萱草污染组的代谢物中发现了4种特殊的代谢物(图 6和图 8)，丙氨酸，肉豆蔻酸、棕榈酸和亚油酸. 类似地，Hu等[30]在研究纳米材料氧化石墨烯(GO)污染对小麦代谢的影响时，也在污染组发现了特殊的代谢物：亚油酸和阿拉伯呋喃糖. 结果说明一些异生型环境污染物的暴露会诱导生物内部代谢调控紊乱，进而改变生物的代谢流，引起某些代谢物含量的显著变化，或产生一些特殊的代谢物，这可能是生物面对环境污染物暴露时，发生在代谢层面的响应.

蓝色和红色分别代表着污染组代谢物含量明显(P＜0.01)高于和低于空白组；绿色和橙色分别代表TPHs 40 000 mg ·kg-1明显高于和低于空白组和TPHs 10 000 mg ·kg-1；黑色框中的代谢物代表在试验组可以检测出，在空白对照组未检出的代谢物；实线和虚线分别代表的直接和间接的代谢途径图 8 暴露于不同TPHs处理下，萱草根系的初生代谢流示意 Fig. 8 Primary metabolic flux map of H. middendorfii in roots exposed to different TPHs treatments

3 结论

(1)通过对大港油田TPHs污染土壤5个月的盆栽试验，发现萱草对TPHs污染具有一定的耐性，并显著地(P＜0.05)促进了TPHs污染土壤中TPHs的去除，因此萱草具备了用于TPHs(≤40 000 mg ·kg-1)污染土壤的修复能力.

(2)通过PCA和PLS-DA分析土壤各成分对TPHs去除的贡献，发现萱草的种植确实改变了土壤各成分的分布特征，并发现喃葡萄糖、丁酸、果糖、己二酸、核糖、葡萄糖酸、赖氨酸(VIP值＞1.20)，对土壤TPHs的去除起到关键的作用.

(3)土壤检测到的各成分种类中有36种与萱草根系代谢物相同，而且大部分代谢物的相对含量远大于土壤各成分，这可能是萱草将代谢物以根系分泌物的形式释放到了根际区，进而促进土壤TPHs的去除，这是一个重要的TPHs根际修复机制.

(4)对萱草根系代谢物的分层聚类和初生代谢流分析，发现TPHs的暴露确实改变了萱草根系的代谢. 这可能是植物对土壤TPHs暴露作出的代谢响应，或者说是一种适应性响应.