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鸢尾对石油烃污染土壤的修复以及根系代谢分析

花匠小妙招
2024-11-10 05:30

摘要: 本研究采用温室盆栽方式,探讨了野生花卉鸢尾(Iris pseudacorus L.)对大港油田石油烃污染土壤的修复能力,并对石油烃暴露下鸢尾根系代谢组学进行了分析. 结果表明,鸢尾对石油烃含量≤40000 mg ·kg-1具有良好的耐性; 鸢尾对高含量石油烃污染土壤的修复效果比较显著,当土壤石油烃含量为10000、20000和40000 mg ·kg-1时,其去除率分别为42.1%、33.1%和31.2%,明显高于空白对照组(31.8%、21.3%和11.9%)(P<0.05). 通过根系扫描,发现在10000、20000和40000 mg ·kg-1的石油烃暴露下,根系比表面积均高于空白对照组. 经聚类分析发现根系代谢从整体上发生了不同程度的变化,同时某些代谢物的含量或种类也发生了极显著的变化(P<0.001). 通过偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)发现11种代谢物(VIP值>1.2),它们对根系比表面积的改变起到实质性的贡献. 其中,5种与根系比表面积呈正相关,分别为草酸、乳酸、延胡索酸、磷酸和丙二酸,而与葡萄糖酸、尿苷、丁酸、麦芽糖、亚油酸和苯丙氨酸呈负相关. 可见,鸢尾用于修复高含量石油烃污染土壤具有实践上的可行性,并且关于根系代谢分析有利于更好地理解植物对石油烃污染土壤的代谢响应并揭示其修复机制.

Phytoremediation of Petroleum Contaminated Soils with Iris pseudacorus L. and the Metabolic Analysis in Roots

Abstract: In this study, we performed a greenhouse pot-culture experiment to investigate the potential of a wild ornamental plant Iris pseudacorus L. in remediating petroleum contaminated soils from the Dagang Oilfield in Tianjin, China. The results suggested that Iris pseudacorus L. had great resistance to ≤40000 mg ·kg-1 of total petroleum hydrocarbons (TPHs). The removal rate of TPHs with concentrations of 10000 mg ·kg-1, 20000 mg ·kg-1 and 40000 mg ·kg-1 in soils by Iris pseudacorus L. was 42.1%, 33.1%, 31.2%, respectively,much higher than those in the corresponding controls (31.8%, 21.3%, 11.9%, respectively) (P<0.05). The root specific surface area of Iris pseudacorus L. was determined by the root scanner. The results suggested that TPHs with concentrations of 10000 mg ·kg-1, 20000 mg ·kg-1 and 40000 mg ·kg-1 in soils increased the root specific surface area comparing with the controls. Additionally, the metabolic analysis showed that root metabolism changed to different degrees under the stress of TPHs, and the levels or species of metabolites had a significant change (P<0.001). Furthermore, the results showed that 5 of 11 metabolites(VIP value>1.2)with the root specific surface area from the PLS-DA model analysis, including ethanedioic acid, lactic acid, 2-butenedioic acid, phosphate and propanedioic acid, were positively correlated with the root specific surface area, but the others, gluconic acid, uridine, butanoic acid, maltose, 9,12-octadecadienoic acid, phenylalanine, were negatively correlated with it. In conclusion, using Iris pseudacorus L. to remediate petroleum contaminated soils is feasible, and the metabolic analysis in roots is useful to better understand the metabolic response of plants exposure to petroleum contaminated soils, and then reveals its remediated mechanisms.

Key words:phytoremediation total petroleum hydrocarbons (TPHs) contaminated soil Iris pseudacorus L. roots metabolic analysis

石油烃(total petroleum hydrocarbons，TPHs)是在石油用于人类不同活动过程中产生的，是常见的环境污染物，它主要包括脂肪烃、杂环烃、芳香烃、沥青质和其它顽固组分[1]. 由于石油烃特殊的物理化学属性，例如粘连性、疏水性等，使得进入生物体内后，很难被直接利用或代谢，具有蓄积毒性、诱变性和致癌性，因此对人类健康和生态安全造成严重的威胁[2, 3, 4, 5]. 植物修复是利用特殊的植物和根际微生物降解、吸收以及代谢，去除土壤、沉积物、地下水、地表水，甚至空气中的污染物[6]. 该方法适用于污染面积大且程度较轻的污染场地，是一种对石油烃污染土壤具有潜力的修复方法. 迄今为止，国内外已经筛选出多种可用于修复石油烃污染土壤的植物品种，大多属于禾本科植物，而野生花卉植物鲜有报道[7]. 野生花卉植物不仅可以美化环境，避免污染物进入食物链，而且也具有一定的经济效益，因此从大量的野生花卉中筛选出高效石油烃修复植物具有一定的现实意义[1]. 目前，凤仙花(Impatiens balsamina L.)、紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)、牵牛花(Pharbitis nil L.)、长药八宝[Hylotelephium spectabile (Boreau) H. Ohba][1, 2, 7, 8]等野生花卉相继被发现具备高效去除土壤石油烃的能力.

代谢组学被广泛应用于微生物学、植物学和疾病诊断等领域，通常它被定义为对生命系统的病理、生理刺激或遗传操作引起的动态多参数响应的定量测定，这既是对其它“组学”研究的补充，也是调查代谢多样性的有力工具[9]. 近年来，在代谢组学的基础上，形成了一个新兴领域——环境代谢组学，它是应用代谢组学描述生物体与环境的相互关系[10]. 气质(GC-MS)、液质(LC-MS)、核磁共振(NMR)是主要的分析工具[11]. 目前，代谢组学已被用于多种环境问题的研究工作，包括污染物的代谢响应、环境风险评价、表型变异、代谢网络的构建[10, 12, 13]等. 关于植物代谢组学的研究有利于人们更好地了解植物系统对遗传和环境因素改变的响应[14]，而且研究发现代谢上的不同是生物抵抗外界环境压力和提高耐性的重要策略[15]. 因此将代谢组学的研究结果与代谢工程、基因工程以及蛋白工程结合，有利于改善植物的耐性和提高修复效果.

鸢尾(Iris pseudacorus L.)属天门冬目，鸢尾科鸢尾属多年生草本，是一种常见的野生花卉植物，已有研究发现鸢尾可以强化去除环境中的一些污染物，例如Pb、 Cd、 Cu和莠去津[16, 17, 18]，说明鸢尾对某些污染物具有一定的耐性和修复能力，因而认为鸢尾可能具有修复石油烃污染土壤的能力. 本研究通过5个月温室盆栽试验，从鸢尾对污染的耐性、对石油烃的降解能力探讨了鸢尾修复石油烃污染土壤的可行性，将为石油烃污染土壤的植物修复提供新的思路. 此外，本研究还首次分析了鸢尾根系在石油烃污染土壤暴露下的代谢响应. 并将代谢物的VIP(variable importance in the projection)值和coeffCS (coefficient centered and scaled X data)系数结合，进一步分析对根系比表面积起到实质性贡献的代谢物. 关于鸢尾根系代谢分析有利于进一步理解石油烃暴露下，植物内部代谢途径的调控机制.

1 材料与方法 1.1 试验土壤

本试验过程中使用的污染土均采自大港油田第一采油厂，清洁土取自天津市滨海新区森林公园，清洁土石油烃污染土的物理化学属性见表 1. 将采来的大港油田原污染土晾干，研磨，然后过10目筛子，待用. 土壤采集测定时，每个样品都保证在土壤的不同位置随机取样3次，以其均值作为测定值，以确保土样的代表性.

表 1 供试土壤的物理化学属性Table 1 Chemical and physical characteristics of the soils used in the experiment

1.2 盆栽试验设计

盆栽试验位于天津南开大学泰达学院温室内，温室温度在18-25℃,每天保持光照16 h，黑暗8 h.

盆栽试验设定的污染土壤石油烃的含量为0、 5 000、 10 000、 20 000和40 000 mg ·kg-1. 根据大港油田污染土的含量，人为将污染土与清洁土按照一定的比例混合均匀，得到对应污染土的实际含量：0、 4 961、 11 829、 22 261和39 941 mg ·kg-1，土壤的pH 7.65-8.32，含盐量为0.3%-5.3%. 然后按照每盆装土1.5 kg的标准，将稀释得到的不同含量石油烃污染土壤装入花盆(直径230 mm，高180 mm),每个污染梯度设3 个平行，同时准备空白对照组，共30盆，浇水平衡2 周后待用.

供试植物为鸢尾(Iris pseudacorus L.)购买自北京绿普方圆花卉有限公司. 盆栽试验采用栽种的方式进行. 选取生长趋势差不多的鸢尾，用自来水清洗其根部，然后栽种在平衡好的土壤中，每盆2棵，试验期间每天早上浇适量的水，空白对照组与试验组处理一致，种植5个月后收获.

1.3 石油烃(TPHs)的测定

土壤石油烃的测定方法参考索氏提取方法(US EPA 3550c)[7].

1.4 生物量

为了更好地评价鸢尾对石油烃的耐性，在收获时，需要对其生物量进行测定. 具体操作如下，将收获后的植株用自来水冲洗干净，再用去离子水充分洗净黏在植株上的泥土，用滤纸擦干表面的水分，然后用剪刀将植株的根部与地上部分开，测量其鲜重、株高、根长，同时用EPSON PERFECTION V700 PHOTO扫描仪及WinRHIZO软件进行扫描并计算根系比表面积(根总表面积/根总体积).

1.5 鸢尾根系代谢组学分析

鸢尾根系代谢组学采用衍生化后GC-MS进行分析，具体方法见文献[13].

1.6 统计分析

数据统计与分析采用SPSS 20.0与Origin 9.0进行. 按照单因素方差分析(ANOVA)方法中LDS进行多组样本间的显著性检验，规定显著性水平P＜0.05. 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)使用SIMCA-P11.5进行. 同时用MeV4.9.0软件绘制代谢物热图，并使用HCL模型进行聚类分析，相关参数距离选择默认距离即皮尔森相关(Pearson correlation)，联系方法选择平均联系聚类(average linkage clustering).

2 结果与讨论 2.1 鸢尾对石油烃(TPHs)的耐性

植物种植5个月后，将其收获，生长状况见图 1(a). 以鸢尾的株高、根长以及鲜重为耐性指标，来评价鸢尾对石油烃的耐性. 由图 1(b)和1(c)可看出与空白对照组相比，石油烃的存在，对鸢尾株高、根长和鲜重都没有明显的抑制作用，反而促进了它们的生长. 尤其是在40 000 mg ·kg-1污染下，其生长趋势最好. 这与笔者原来筛选的石油烃修复野生花卉植物凤仙花(Impatiens balsamina L.)、紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)、牵牛花(Pharbitis nil L.)和长药八宝[Hylotelephium spectabile (Boreau) H. Ohba][1, 2, 7, 8]的结果有所不同. 通过对这4种野生花卉植物根部生物量的分析，发现石油烃含量为5 000 mg ·kg-1和10 000 mg ·kg-1时无明显的抑制作用，而在20 000 mg ·kg-1和40 000 mg ·kg-1下具有明显的抑制作用. 这说明不同植物对石油烃的耐性是不同的，与它们相比，鸢尾对石油烃(≤40 000 mg ·kg-1)具有良好的耐性，然而关于其耐性机制还不是很清楚，尚待进一步研究.

标注不同小写英文字母表示地上部生物量的显著性差异，大写英文字母表示根部生物量的显著性差异(P＜0.05) ； YCK，鸢尾，空白对照组； Y0.5%，鸢尾，TPHs 5 000 mg ·kg-1； Y1%，鸢尾，TPHs 10 000 mg ·kg-1； Y2%，鸢尾，TPHs 20 000 mg ·kg-1； Y4%，鸢尾，TPHs 40 000 mg ·kg-1图 1 不同TPHs处理下鸢尾收获时的一组图片以及生物量 Fig. 1 A set of pictures during harvesting Iris pseudacorus L. and the biomass of Iris pseudacorus L. under different TPHs treatments

2.2 石油烃(TPHs)的去除和植物修复

植物收获后，对试验组根际土以及空白对照组土壤进行石油烃含量测定，评价其植物修复效果(图 2). 在5 000、 10 000、 20 000和 40 000 mg ·kg-1污染含量下，鸢尾对石油烃的去除率分别为22.7%、 42.1%、 33.1%和 31.2%，而空白对照组为28.9%、 31.8%、 21.3%和 11.9%. 在5 000 mg ·kg-1时，植物修复效果不明显，而当石油烃含量≥10 000 mg ·kg-1时，鸢尾的存在显著地促进了石油烃的去除(P＜0.05)，说明鸢尾适合于高含量石油烃(≥10 000 mg ·kg-1)污染场地的修复，这可能是因为低污染程度而高有机质存在的情况下，一些非石油烃的有机质，尤其是一些根系分泌物，更易被微生物利用，因而抑制微生物对土壤石油烃的降解[19]. 当土壤石油烃含量为5 000、 10 000、 20 000和 40 000 mg ·kg-1时，试验组石油烃的去除率分别是空白对照组的0.79、 1.32、 1.55和 2.62倍，可能是由于石油烃对土壤中的微生物具有生物毒性效应，而植物的存在缓解了这种毒性效应，并且这种缓解作用随着石油烃含量的增加更加明显，进而促进了土壤石油烃的去除.

标注不同小写英文字母表示具有差异显著性 (P＜0.05) 图 2 不同含量TPHs处理下，种植鸢尾试验组与未种植空白对照组对TPHs的去除率 Fig. 2 Removal rate of TPHs in different soils planted with Iris pseudacorus L. and the unplanted controls

迄今为止，国内外已经有不少关于植物修复污染土壤的相关报道. 植物对污染修复的贡献可分为两大方面：①植物自身对污染物的吸收、转化和富集作用[20]； ②为微生物的生存提供有利的生态条件，促进微生物对污染物的生物降解作用[21]. 对于有机污染物来说，微生物降解作用是其主要的去除方式[22]. 然而许多研究发现一些难降解的污染物，在有植物存在的情况下更易被降解[1, 2, 8, 23]. Basumatary等[24] 经过1a的培养试验，发现短叶茳芏[Cyperus brevifolius (Rottb.) Hassk]对8%的原油污染土壤总油脂的降解率高达61.2%，明显高于空白对照组(13.7%). 唐景春等[25]经过3个多月的培养试验，发现玉米草(Zea mexicana)对7.7%石油烃污染土石油烃降解率达到23.6%，显著高于自然降解情况(12.8%). 陈嫣等[26]也发现披碱草(Elymusdahuricum)和紫花苜宿(Medicago sativa L.)可以促进6.15%石油烃污染土中石油烃的降解. 植物的引入，可以在根系周围形成一个特殊的修复圈层——根际，不仅可以为微生物提供良好的栖息环境，而且可以通过释放根系分泌物，为微生物提供可利用的碳源或共代谢物质[27, 28, 29]，促进根际微生物的生长和代谢活性，还可以增加污染物的生物有效性[23]，从而强化污染物的去除.

2.3 石油烃暴露下根系代谢分析

鸢尾根系代谢物经过GC-MS分析后，大约有200个物质峰，最后经数据处理得到62种代谢物. 大部分的代谢物是初生代谢途径中产生的，包括氨基酸、有机酸、糖类、糖醇和糖酸以及其它组分. 图 3(a)是对鸢尾根系代谢物进行分析得到的热图，热图代表各种代谢物的相对含量. 使用分层聚类 (hierarchical cluster，HCL)模型对不同含量石油烃污染下，鸢尾根系代谢物进行分析，发现石油烃的存在，引起了根系代谢不同程度的改变. 与高含量的石油烃(20 000 mg ·kg-1和40 000 mg ·kg-1)相比，低含量石油烃(5 000 mg ·kg-1 和10 000 mg ·kg-1)与空白对照组的代谢物更加相似. 而且仅在污染组的代谢物中发现了黄嘌呤，它属于生物碱，是一种核酸代谢物[30, 31]. Son等[31] 在研究小鼠老龄化时，发现随着小鼠的老龄化程度增加，能量供给会失调，而且引起黄嘌呤含量的增加，这可能与活性氧(ROS)在肝部的蓄积有关. 类似地，石油烃的存在可能会对鸢尾根系造成氧化压力，引起ROS在根部蓄积，进而引起黄嘌呤的产生. Hu 等[32]在研究氧化石墨烯(GO)对小麦代谢组学的影响时，发现GO的出现会影响小麦的初生代谢途径，并且仅在污染组发现了特殊物质，亚油酸和阿拉伯呋喃糖. 这说明一些环境外源性物质的存在可能会改变生物化学过程，从而产生一些特异性物质或生物标志物.

“※ ”代表在污染组中可以检测出，而在空白对照组未检出的代谢物； YCK，鸢尾，空白对照组； Y0.5%，鸢尾，TPHs 5 000 mg ·kg-1； Y1%，鸢尾，TPHs 10 000 mg ·kg-1； Y2%，鸢尾，TPHs 20 000 mg ·kg-1； Y4%，鸢尾，TPHs 40 000 mg ·kg-1图 3 不同含量TPHs暴露下鸢尾根系代谢分析 Fig. 3 Metabolic analysis in roots of Iris pseudacorus L. exposed to different TPHs treatments

从图 3(b)可以看出与空白对照组相比，石油烃的存在，极显著(P＜0.001)地改变了10种代谢物的含量，包括甘氨酸、天冬氨酸、苹果酸、 2,3,4-三羟丁酸、 2-酮戊二酸、木焦油酸、松二糖、戊糖、甘油以及环己烯. Zhang 等[33]在研究城市污水(MWWE)对小鼠代谢的影响时，发现污染物的存在会改变小鼠血清中代谢物的含量，胆碱减少为0.46倍，乳酸上升为1.61倍，脯氨酸1.52倍，磷酸胆碱1.81倍和2-酮戊二酸1.28倍. 这说明一些环境污染物的存在会引起生物内部代谢紊乱，导致某些代谢物的显著变化，这可能是生物对环境压力的一种适应性响应.

2.4 代谢物对根系比表面积的贡献

在植物修复过程中，根系比表面积是一个重要的指标，因为巨大的根系比表面积可以为微生物提供良好的栖息地，也可以通过根系分泌物的释放提供大量的碳源和能源，增加微生物的密度和活性[6, 34]，进而促进土壤石油烃的去除. 与空白对照组相比，当石油烃含量为5 000 mg ·kg-1时，鸢尾根系比表面积没有显著的变化，然而当石油烃含量为10 000、 20 000和 40 000 mg ·kg-1时，根系比表面积高于空白对照组，尤其在20 000 mg ·kg-1时，显著(P＜0.05)高于空白对照组[图 4(a)]. 根系比表面积的增加可能是鸢尾对高含量石油烃暴露的一种适应性响应，有利于土壤石油烃的去除.

标注不同英文字母表示差异显著性 (P＜0.05); 符号“+” 和 “- ”分别代表着代谢物含量对根系比表面积正和负的相关性图 4 不同含量TPHs暴露下，根系比表面积，以及根系代谢物的VIP值及coeffCS系数 Fig. 4 Root specific surface area under the different TPHs treatments,and the VIP value and coeffCS of root metabolites with the root specific surface area

代谢组学不仅可用于研究生物对污染物暴露的代谢响应[10]，而且可以通过与其它技术结合，改变代谢途径，进而改善生物面对污染环境时的生存状态和修复能力. VIP值和coeffCS是评价代谢物重要性的两个参数. 其中VIP值是模型的加权平方和，代表着每个X变量对Y变量的重要性[10]. 当VIP＞1时，变量X对模型具有显著的统计学意义[15, 35, 36]. 而coeffCS 系数是关于代谢方向改变及改变程度的一个重要指示参数[15, 32]. 通过偏最小二乘判别分析法(partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA)分析代谢物对根系比表面积贡献，结果得到11种VIP值＞1.2的代谢物[图 4(b)]，它们对根系比表面积的改变起到实质性的作用. 其中5种与其呈正相关，分别为草酸、乳酸、延胡索酸、磷酸和丙二酸，而与葡萄糖酸、尿苷、丁酸、麦芽糖、亚油酸和苯丙氨酸呈负相关. Hu等[32]在研究石墨烯对小麦代谢影响时发现高VIP值(＞1.3)的代谢物包括赖氨酸、肌糖、脯氨酸和苯丙氨酸与根系数量呈正相关，而与尸胺、链烷类、核糖和亮氨酸呈负相关. 这说明根系代谢的改变不仅可以调节根系数量，同时可以影响根系比表面积. 因此可以通过对代谢组学的分析，寻找对变量产生不同影响的代谢物，然后与代谢工程、基因工程及蛋白工程结合，使得可以按照人们的意愿调节变量的变化趋势，进而改善植物的生存状态和修复能力.

3 结论

(1)通过对大港油田石油烃污染土壤的盆栽试验发现野生花卉鸢尾对石油烃含量≤40 000 mg ·kg-1污染具有良好的耐性，具备用于石油烃污染土壤修复的潜力.

(2)鸢尾适合用于高含量石油烃污染土壤中石油烃的修复，主要表现在当土壤中石油烃的含量为10 000、 20 000和 40 000 mg ·kg-1时，鸢尾对石油烃的去除率分别为42.1%、 33.1%、 31.2%，显著高于空白对照组(31.8%、 21.3%、 11.9%)(P＜0.05)，却抑制了5 000 mg ·kg-1污染土壤石油烃的修复.

(3)鸢尾根系代谢分析结果，显示石油烃的暴露使得代谢从整体上发生了不同程度的变化，并引起了代谢物含量或种类的极显著性变化(P＜0.001). 而且代谢的改变会影响根系比表面积的大小，这可能是植物通过调节自身的代谢对石油烃污染作出的适应性响应.