十字花科芸薹属植物幼苗建成对四环素胁迫的响应及机理研究
十字花科芸薹属植物幼苗建成对四环素胁迫的响应及机理研究
【摘要】： 抗生素的过度使用加剧抗生素耐药菌的产生和抗生素对非靶标生物的毒性作用等环境问题。在抗生素对植物的毒性方面,虽然有关抗生素对植物幼苗生长的影响被广泛地报道,但是缺乏对植物幼苗建成的研究。四环素类抗生素被广泛用作人和动物疾病的治疗剂以及动物生长的促进剂,在环境中存在较高的检出率和检出水平,对植物具有明显的危害作用。十字花科芸薹属作物种子具有大小适中、发芽快和对污染物敏感等特点,在评价四环素植物毒性方面的表现值得系统深入地研究。本论文选用四环素作为目标污染物,系统性地研究了十字花科芸薹属植物幼苗建成对四环素胁迫的响应。首先,比较了两种典型的利用植物暗形态建成实验评价四环素植物毒性的方法。其次,从种子固有特性分析了十字花科芸薹属植物暗形态建成对四环素的敏感性。再次,探索了植物光形态建成对四环素胁迫的响应。最后,从种子贮藏物质活化和氧化应激方面探讨了植物幼苗建成受四环素胁迫的机理。本论文主要的研究内容和结果包括以下七个部分:第一部分以广泛使用的十字花科芸薹属的大白菜种子为受试生物,通过比较两种采用不同样本大小和培养方法的植物暗形态建成实验,对利用该实验评价四环素植物毒性的方法进行了改进。实验一为小样本实验,每组选用80个种子,发芽阶段的种子全部用于胚根伸长阶段的研究。实验二为大样本实验,每组选用160个种子,在种子发芽阶段实验结束后,选取80个大小相近的发芽种子进行胚根伸长阶段的实验。研究发现,大样本实验有利于分析四环素对种子发芽阶段的影响,且实验结果具有统计学意义。此外,选取发芽种子进行胚根伸长阶段的实验,排除了种子发芽阶段实验结果对胚根伸长阶段实验结果的干扰,提高了实验结果的稳定性。第二部分采用了三种十字花科芸薹属典型的作物种子,包括大白菜(Brassica rapa L.)、油菜(Brassica napus L.)和甘蓝(Brassica oleracea L.)。通过植物暗形态建成阶段的实验,探索了利用十字花科芸薹属作物种子评价四环素毒性的测试终点,建立了基于四环素对十字花科芸薹属典型作物毒性数据的物种敏感性分布,从种子固有特性分析同一属不同种间作物对四环素敏感性差异的来源。研究发现,胚根长度是对四环素最敏感的测试终点。基于胚根长度,四环素对植物暗形态建成的LOEC为1-20μM,EC_(50)为35.73-269.77μM。比较EC_(50)值可知,三种十字花科芸薹属作物对四环素的敏感性强弱依次为大白菜>甘蓝>油菜,同一种种子的不同品种间对四环素的敏感性差异大小依次为油菜<大白菜<甘蓝。由EC_(50)数据拟合物种敏感性分布曲线得到的HC_5和HC_(50)分别为28.55和103.29μM。通过对毒性数据和种子固有特性指标进行主成分分析发现,EC_(20)与种子发芽指标相关,EC_(50)与种子贮藏物质的含量相关。第三部分选取了第二部分研究所用种子中具有不同发芽时间的品种,包括对四环素较为敏感的大白菜和油菜。通过建立种子的吸水模型和发芽模型,研究了环境水平四环素(1-5 n M)对植物暗形态建成初期吸水过程和发芽过程的影响及其与种子种皮结构和发芽时间的关系。研究发现,环境水平四环素对种子吸水和发芽过程均有不良影响,但因植物种类而异。种子发芽需要的时间越长,越容易受到四环素暴露的影响。种子表皮上存在的微孔结构影响种子发芽过程对四环素胁迫的响应,而不影响种子吸水过程对四环素胁迫的响应。第四部分选取了第二部分研究所用种子中对四环素最敏感的大白菜品种。根据植物暗形态建成阶段发生的明显变化进一步对发芽过程和胚根伸长过程进行划分,通过不同时期暴露四环素的实验,研究了四环素对植物暗形态建成的毒性作用特点。研究发现,四环素对种子发芽阶段无影响,而对胚根伸长阶段有强烈的抑制作用。在种子发芽阶段暴露四环素与否对胚根伸长阶段暴露四环素的结果无影响。胚根伸长阶段的初期是四环素胁迫对植物暗形态建成最早产生作用的时期,也是植物暗形态建成对四环素最敏感的时期。而且,四环素对胚根的抑制作用具有不可逆性。通过对胚根的伊文思蓝染色和对培养液吸光度(A_(260))的测定发现,四环素胁迫没有破坏胚根细胞膜完整性,但减少了胚根伸长过程中细胞内含物的渗漏。第五部分考虑到植物暗形态建成阶段依赖种子贮藏物质来实现异养生长的特性,研究了四环素对植物暗形态建成阶段贮藏物质活化的影响。子叶透射电镜的分析结果显示,四环素阻碍了子叶中蛋白质体的活化,而对脂质体的活化无影响,且与红外光谱的分析结果一致。对种子各器官能量状态的分析显示,胚根中能量的供给受到了影响。第六部分通过短期光照实验研究了四环素对植物幼苗建成后期光形态建成的影响。研究发现,子叶中光合色素的合成受到了四环素的阻碍。其中,叶绿素a的含量是评价四环素植物毒性的最佳指标。四环素对子叶基于叶绿素a的LOEC和EC_(50)分别为200和498 n M。第七部分考虑到实际环境中盐分胁迫和四环素胁迫共存的情形,通过测定与抗坏血酸–谷胱甘肽循环相关的抗氧化物质、抗氧化酶和活性氧(H_2O_2)以及脂质过氧化产物(MDA),分别探究在植物暗形态建成阶段和光形态建成阶段盐分和四环素双重胁迫对该循环的影响。研究发现,盐分胁迫没有加剧四环素胁迫对植物幼苗建成产生的不利影响。盐分和四环素的单一胁迫和双重胁迫均未对植物依赖抗坏血酸–谷胱甘肽循环维持H_2O_2内稳态的机制产生影响。本论文研究的意义在于挖掘了十字花科芸薹属植物在生态毒理学领域的研究价值。优化了利用传统的植物幼苗建成前期的暗形态建成实验评价四环素植物毒性的方法;从种子贮藏物质组成方面分析了植物暗形态建成对四环素敏感性的差异,为大范围筛选四环素敏感种子用于植物暗形态建成实验提供了一种新的可行的思路;揭示了四环素在植物暗形态建成阶段抑制胚根伸长的作用特点和阻碍贮藏物质活化的作用机理;筛选了利用植物幼苗建成后期的光形态建成实验评价四环素植物毒性的敏感性指标。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2020
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