一种适用于南方根结线虫无菌培养的消毒方法与流程
本发明涉及一种适用于南方根结线虫无菌培养的消毒方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术：
根结线虫(meloidogynespp.)为最主要植物病原线虫，其寄主广泛，常见寄主多达2000余种，遍及粮食和经济作物，以及多种花卉、果树、中药材等，特别是茄科、葫芦科和十字花科植物根结线虫病尤为严重，一般造成减产10％～20％，严重的可达75％以上。由于根结线虫的危害严重，对根结线虫病的研究就显得十分重要。
目前，研究根结线虫和植物互作主要通过两种手段：一种是在自然的生长状态下，根结线虫寄生在以土壤或基质栽培的作物中。如需观察植物与根结线虫的互作情况，首先需要洗根，耗费人工。另一种是根结线虫寄生在培养基培养的无菌植株根系中，培养基透明方便研究观察，根系易于清洗，此方法实施过程中，根结线虫消毒是一大难题，极易引入污染。因此，需要提供一种新的根结线虫的消毒方法解决这一难题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于南方根结线虫无菌培养的消毒方法，本发明消毒方法方便，效果良好，操作简便，成本低。
本发明所提供的适用于根结线虫无菌培养的消毒方法，包括先后采用酒精和硫酸链霉素浸泡根结线虫的步骤。
上述的消毒方法中，所述酒精的体积分数为75±5％。
上述的消毒方法中，所述酒精的用量为：1ml所述酒精：500～550条所述根结线虫；
将所述根结线虫与所述酒精混合均匀后静置4.5～5h。
上述的消毒方法中，于25～27℃的恒温箱中静置。
上述的消毒方法中，采用所述酒精进行消毒之前，优选采用蒸馏水洗涤所述根结线虫，即加入蒸馏水后进行离心，去除上清夜。
上述的消毒方法中，采用所述硫酸链霉素的水溶液浸泡所述根结线虫；所述酒精消毒结束后，经离心去除上清液。
上述的消毒方法中，所述硫酸链霉素的水溶液的质量浓度可为0.6～0.9％，优选0.7％。
上述的消毒方法中，所述硫酸链霉素的用量为：1ml所述硫酸链霉素的水溶液：500～550条所述根结线虫；
将所述根结线虫与所述硫酸链霉素混合均匀后静置4.5～5h。
上述的消毒方法中，于25～27℃的恒温箱中静置。
上述的消毒方法中，经所述硫酸链霉素消毒后，采用无菌蒸馏水重复清洗多次：离心后去除上清液，加入无菌蒸馏水，离心后去除上清液，反复多次上述无菌蒸馏水的洗涤。
经洗涤后的根结线虫再次加入至无菌蒸馏水中，悬浮，即可接种于无菌培养的植物根系中，如黄瓜、番茄等蔬菜作物。
本发明方法适用于南方根结线虫的消毒。
本发明方法具有如下优点：
本发明方法采用的酒精、硫酸链霉素等方便购买，成本低；本发明方法操作简便，不会造成污染，效果显著。
附图说明
图1为实施例1中采用酒精和硫酸链霉素消毒的条件下接种根结线虫后的植株污染情况。
图2为对比例1中采用次氯酸钠消毒的条件下接种根结线虫后的植株污染情况。
图3为对比例2中采用硫酸链霉素消毒的条件下接种根结线虫后的植株污染情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
样本前处理：在无菌条件下，播种番茄种子，待番茄苗播种到组培瓶15天，产生大量根系后，准备接种南方根结线虫二龄幼虫。清洗植物根系，挑取卵块加少许蒸馏水，置于恒温培养箱中，孵化3天左右。
实施例1、采用酒精和硫酸链霉素的消毒方法
(1)每1.5ml离心管管中200条南方根结线虫，在3000rpm下离心2min，去除上清液。
(2)加入1ml蒸馏水在3000rpm下离心2min去除上清液，加入1ml75％酒精(体积)，颠倒摇匀充分混合，之后静置5h，25～27℃恒温箱中。
(3)离心2min去除上清液。加入1ml0.7％硫酸链霉素水溶液，颠倒摇匀充分混合，之后静置5h，置于25～27℃恒温箱中。
(4)在3000rpm下离心2min，去除上清液，加无菌蒸馏水1ml，离心2min，去除上清液。
(5)加入0.2ml无菌蒸馏水，悬浮，准备接种。
对比例1、采用次氯酸钠消毒方法
(1)用800目的细胞过滤器分离南方根结线虫二龄幼虫和卵块。
(2)使用0.52％体积分数的次氯酸钠水溶液浸泡30s，用无菌蒸馏水冲洗2～3次至无味。
(3)线虫消毒完毕，准备接种。
对比例2、硫酸链霉素消毒方法
(1)每1.5ml离心管中500条南方根结线虫，在3000rpm下离心8min，去除上清液。
(2)加入1ml蒸馏水在3000rpm下离心8min去除上清液，加入1ml0.7％硫酸链霉素，颠倒摇匀充分混合，之后静置10h，置于25～27℃恒温箱中。
(3)在3000rpm下离心8min，去除上清液，加无菌蒸馏水1ml，离心8min，去除上清液。加入0.2ml无菌蒸馏水，悬浮，准备接种。
观察实施例1、对比例1-2的组培瓶接种完根结线虫观察植株污染情况，分别如图1-图3所示。
表1无菌条件下不同消毒方法植株污染情况
由表1和图1-3可以看出，采用次氯酸钠(消毒强度大于酒精)和硫酸链霉素单独消毒南方根结线虫，接种南方根结线虫后，均造成植株污染，而联合采用酒精和硫酸链霉素消毒南方根结线虫，接种南方根结线虫后，取得了意料不到的技术效果，没有造成植株污染，效果显著。
由上述结果(表1和图1-3)可以看出，本发明通过采用酒精和硫酸链霉素先后对南方根结线虫进行消毒的方式，克服了现有方法存在的污染的问题，表明酒精和硫酸链霉素的联合使用取得了显著的技术效果。
技术特征：
1.一种适用于根结线虫无菌培养的消毒方法，包括先后采用酒精和硫酸链霉素浸泡根结线虫的步骤。
2.根据权利要求1所述的消毒方法，其特征在于：所述酒精的体积分数为75±5％。
3.根据权利要求1或2所述的消毒方法，其特征在于：所述酒精的用量为：1ml所述酒精：500～550条所述根结线虫；
将所述根结线虫与所述酒精混合均匀后静置4.5～5h。
4.根据权利要求3所述的消毒方法，其特征在于：于25～27℃的恒温箱中静置。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的消毒方法，其特征在于：采用所述硫酸链霉素的水溶液浸泡所述根结线虫。
6.根据权利要求4所述的消毒方法，其特征在于：所述硫酸链霉素的水溶液的质量浓度为0.6～0.9％。
7.根据权利要求4或5所述的消毒方法，其特征在于：所述硫酸链霉素的用量为：1ml所述硫酸链霉素的水溶液：500～550条所述根结线虫；
将所述根结线虫与所述硫酸链霉素混合均匀后静置4.5～5h。
8.根据权利要求7所述的消毒方法，其特征在于：于25～27℃的恒温箱中静置。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的消毒方法，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫。
10.酒精和硫酸链霉素在根结线虫消毒中的应用。
技术总结
本发明公开了一种适用于南方根结线虫无菌培养的消毒方法。所述方法包括先后采用酒精和硫酸链霉素浸泡根结线虫的步骤；所述酒精的体积分数为75±5％；所述硫酸链霉素的水溶液的质量浓度为0.6～0.9％。本发明方法采用的酒精、硫酸链霉素等方便购买，成本低；本发明方法操作简便，不会造成污染，效果显著。
技术研发人员：王绍辉;姜曼;赵文超;黄煌;孙路路;杨瑞;刘杨
受保护的技术使用者：北京农学院
技术研发日：2019.09.25
技术公布日：2019.12.10
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