首页 > 分享 > 华中农大近期科研进展

华中农大近期科研进展

花匠小妙招
2024-11-10 21:22

在作物纳米抗逆研究中取得新进展

近期，华中农大吴洪洪教授课题组设计新型农业纳米材料提高作物抗逆性并解析其相关机理，有关成果在ACS Nano，Plant Biotechnology Journal等国际学术期刊在线发表。

通过设计不同电荷的碳点，并研究其在四种不同的细胞类型（原生质体、分离的单个细胞、再生的单个细胞和完整的叶细胞）中的转运规律，吴洪洪/李召虎课题组发现细胞壁果胶含量的多寡是叶细胞偏向吸收负电碳点的一个影响因素。相较于PEI（聚乙烯亚胺）包被的带正电荷的碳点，带负电荷的碳点更容易被原生质体、再生的单个细胞和叶肉细胞中吸收。而在分离的单个细胞中表现出相反的趋势。细胞壁成分含量的结果显示，分离的单个细胞和再生的单个细胞之间，总细胞壁的含量没有显著变化。再生的单个细胞中果胶（水溶性果胶、螯合态果胶和碱性果胶）含量较高，而纤维素含量较低（如图1）。此外，该研究还提供了一种系统评估细胞壁成分在递送带电纳米颗粒中的作用的方法，不仅有助于更好的理解细胞屏障和纳米颗粒之间的相互作用，也为农业生产中高效应用纳米颗粒提供设计思路。相关成果在ACS Nano上在线发表。华中农大植物科学技术学院博士后朱岚为论文第一作者。

▲图1

此外，吴洪洪课题组在利用纳米材料维持活性氧稳态提高棉花耐盐的机制方面也取得了新进展。盐碱是一个全球性问题，严重限制了作物的高效生产。吴洪洪课题组首先设计合成了聚丙烯酸修饰的Mn3O4纳米颗粒(PAA@Mn3O4-NPs, PMO)，并验证其具有多种抗氧化酶模拟活性，能够在体外清除活性氧。进一步的实验结果表明，PMO可以清除盐胁迫下叶肉细胞中过量累积的ROS和维持细胞的Na+/K+稳态以缓解盐胁迫对植物的影响，提高棉花的耐盐能力（如图2）。相关研究成果在Plant Biotechnology Journal上在线发表。

▲图2

华中农大植物科学技术学院已毕业博士生刘家浩、化学学院顾江江老师以及已毕业硕士生胡金为论文共同第一作者，吴洪洪教授和李召虎教授为上述论文的通讯作者。上述研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金项目、华中农大与中国农科院深圳基因组所联合项目等项目资助。

揭示转座子驱动金柑属植物自交不亲和性状丢失新机制

近日，国际植物学期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了华中农大果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/洪山实验室邓秀新院士团队柴利军教授组学术论文。研究系统证实控制自交不亲和S位点中S-RNase启动子附近MITE转座子的插入导致了芸香科金柑属（Fortunella）植物自交不亲和性状的丢失，且转座子插入事件在S-RNase介导的植物自交不亲和系统中具有广谱性，拓展了人们对植物自交不亲和向自交亲和性转变机制的新认识，建立了金柑属植物苗期分子标记辅助快速鉴定亲和性状技术体系，为柑橘种质创新与新品种培育提供了新思路，具有重要的理论及应用价值。

本研究以山金柑为研究对象，山金柑属于柑橘亚科金柑属植物，由于其具有极短的童期，播种当年可开花；超长的花期（武汉地区：5月初-9月底）；易于遗传转化等特性，已经成为柑橘基因功能研究的模式材料。课题组前期经多年系统搜集和鉴定表明自然种群山金柑中包含自交不亲和及自交亲和两种生殖类型，为解析金柑属资源亲和转变机制奠定了材料基础。

▲正向遗传学初定位S位点

为了探究山金柑（F. hindsii）由自交不亲和（Self-incompatibility, SI）向自交亲和（Self-compatibility,SC）转变的遗传基础，本研究基于已构建的PN02 × DB02杂交群体（其中PN02系为母本，为自交不亲和，基因型：S8S19；DB02系为父本，为自交亲和，基因型：S2S29），并对其杂交F1子代的SC表型进行了鉴定。经连续两年重复，共获得186个F1子代单株的自交亲和表型，其中SC与SI的分离比约为1:1（SC:SI = 98:88; χ2 = 0.54, P = 0.46）。基于全基因组测序分别选择32个SC和SI表型的F1单株用于BSA（Bulk Segregation Analysis, 混池分离群体分析）分析，在1号染色体亚端粒区发现一个与SC/SI相关的峰（0.83~2.38 Mb, G’ value = 11, P= 10-3）。基于KASP（Kompetitiveallele specific PCR, 竞争性等位基因特异性PCR）基因分型分析，从186株F1杂交子代中鉴定到18个在BSA定位区间发生重组的单株。依据其中的两个重组单株（PD02-211和PD02-270）及其自交亲和表型，明确了山金柑SC关键的遗传位点位于K961397和K1247997这两个标记之间，共286.6 kb的区间。该候选区间与控制柑橘自交不亲和性的S位点重叠，其中包含35个注释基因，包括14个F-box基因、1个S2-RNase基因（命名为FhiS2-RNase）和20个S位点侧翼区域的保守结构基因。

SC相关的位点在群体中通常处于强选择状态。针对这一候选区域，本研究计算了山金柑自交亲和自然群体的EHH（Extended Haplotype Homozygosity, 扩展单倍型纯和度），测量了携带特定核心等位基因单倍型的衰减作为距离的函数，并获得了每个SNP的iHS（integratedhaplotype score, 综合单倍型得分）统计数据，以寻找近期有正选择迹象的基因组区域。在FhiS2-RNase的基因组区域发现了一个强烈的正选择信号，该区域包含75个显著的SNPs（P = 10-3），并与上述35个注释基因中的13个相关。此外，杂交群体F1子代SC表型与S2-RNase基因型密切相关。序列比对结果表明，S2-RNase基因编码区在不同柑橘属间和种间存在几个同义和非同义突变，其中FhiS2-RNase编码的氨基酸序列相对于其他5个不同属间和种间的S2-RNase基因（PtrS2-RNase, CmeS2-RNase, AbuS2-RNase,CgrS2-RNase和CreS2-RNase）相比，在C端多出12个氨基酸残基，但这并未改变其保守结构域（C1-C5）。

负频率依赖选择是SI的一个关键特征，它决定了S位点等位基因的进化动态。本研究对来自中国5个省的46份山金柑核心种质资源的基因型和自交不亲和表型进行了鉴定。其中S2-RNase基因型的占比最高（30/46），高达33.7%。值得注意的是，所有包含S2-RNase基因型的种质均为自交亲和。为了检测山金柑SC和SI种群之间的正选择特征，本研究对其进行了XP-EHH（Cross-Population Extended Haplotype Homozygosit, 跨群体扩展单倍型纯和度）分析。在3条染色体上检测到4个选择信号，共获得34个假定有利的正选择基因，其中17个基因与KASP基因分型结果重叠，表明包括FhiS2-RNase在内的这些基因在自交亲和山金柑品系中被强烈选择。

▲MITE转座子对S-RNase基因表达影响

为了进一步评估FhiS2-RNase是否是山金柑从SI向SC转变的候选基因，基于卡方检验（χ2-square）分析了自交亲和山金柑自交子代（S1）中S基因型的分离比率。自花授粉PD02-229（S2S8）的子代S单倍型，并不是按照1:2:1的比例分离，而是按照1:1（S2S2:S2S8 = 62:63）的比例分离，且在S1子代中并未出现S8S8的基因型，这一结果与S2位点的异常相一致（1:1, χ2= 0.01, P = 0.93）。此外，来自于自花授粉PD02-482（S2S19）的116个子代单株的基因型分离比也遵从1:1（S2S2:S2S19 = 55:61; 1:1, χ2 =0.31, P = 0.58），并且其S1子代中也未出现S19S19基因型。这些数据表明，只有携带S2等位基因的花粉，而不是携带S8或S19等位基因的花粉，能够传递给S1子代，结果进一步支持了FhiS2-RNase基因型与山金柑SI的丢失密切相关。

实时半定量PCR（qRT-PCR）结果显示，自交亲和山金柑DB02系花柱组织中FhiS2-RNase基因的表达显著被抑制，表明FhiS2-RNase的这些改变可能是导致山金柑自交亲和的原因。在对山金柑和枳（ZK8，Poncirus trifoliata）的S2位点序列进行比对时，发现位于FhiS2-RNase基因启动子上游1071 bp处存在一个786 bp的插入序列。由于不同柑橘属的S2-RNase基因非编码区存在显著差异，只有枳（ZK8）和山金柑在该区域具有较高的同源性。基于P-MITE数据库和RepeatMasker软件预测结果，确定了这786 bp的插入序列是一个属于hAT（hobo, Ac and Tam3）家族的MITE（Miniature inverted-repeat transposable elements）转座子。

为了确定该MITE转座子的插入是否影响了FhiS2-RNase基因的表达，将来自山金柑的不同启动子片段插入到pGreenⅡ 0800-LUC和pKGWFS7载体中，构建重组质粒。随后，将这些重组载体转入到山金柑DB02系的愈伤组织中，并检测了LUC（luciferase,荧光素酶报告基因）的表达。去掉了MITE转座子后的重组载体（FhiS2-RNaseproΔMITE::LUC），其启动子活性得到了显著增强（P = 3.36 × 10-5），这一结果与GUS组织化学染色结果一致。此外，当在枳S2-RNase基因启动子相同位置上插入该MITE转座子（PtrS2-RNasepro+MITE::LUC），其PtrS2-RNase启动子活性则显著降低（P = 9.59 × 10-7）。这些数据显示，MITE转座子的插入可以调控山金柑中FhiS2-RNase基因的表达水平，同时786 bp的MITE转座子插入可能是山金柑SI丢失的原因。

▲MITE转座子活体功能验证

多年生木本植物开展活体基因功能验证耗时长，难度大，但为了确认FhiS2-RNase启动子中的MITE转座子插入是否导致其低水平表达，本研究构建了去除786 bp MITE插入的互补转基因株系（FhiS2-RNaseproΔMITE::FhiS2-RNase-DB02）。在获得的3个稳定开花的转基因株系中，2个株系FhiS2-RNase基因的相对表达量提高了约20倍，苯胺蓝染色结果显示，其花柱可以排斥自我花粉管的生长，表明与对照相比，SI表型已经得到恢复。此外，本研究还发现S2-RNase (PtrS2-RNase)在ZK8 (P. trifoliata, S2S31)花柱组织中的表达量显著高于DB02 (F. hindsii, FhiS2-RNase)，其启动子与FhiS2-RNase相比缺少了786 bp的MITE转座子插入。这些结果表明，786 bp的MITE转座子插入抑制了FhiS2-RNase的表达，并导致了山金柑SI的丢失。

进一步对柑橘家族S位点分析显示，MITE转座子插入事件在柑橘不同属间和种间S-RNase等位基因附近频繁发生，而且特定的MITE转座子插入会影响宿主基因的表达（FhiS2-RNase，PtrS31-RNase及CreS31-RNase），在柑橘SI丢失中起重要作用。此外，在其他常见配子体自交不亲和（gametophyticself-incompatibility）物种中也观察到MITE转座子在S-RNases等位基因附近插入，以上结果表明，基于S-RNases的SI系统中，MITE介导的SI丢失普遍存在。

▲MITE转座子广谱性存在

SI的丢失在适应性进化过程中起着至关重要的作用，随着越来越多的功能性转座子（TEs，Transposable elements）被发现，转座子对物种分化和驯化的影响将会进一步得到阐释。本研究对S-RNases相关的MITE转座子插入在自交进化中的功能分析拓宽了人们对自交不亲和系统遗传基础的理解，也为后续S-RNase和SLF特异性识别的生化基础及共同进化研究奠定了坚实的基础。

华中农大博士后胡健兵为论文第一作者，果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室、洪山实验室固定研究人员柴利军教授为论文通讯作者。

利用高通量基因编辑系统创建棉花抗虫基因突变体库并鉴定到广谱抗虫基因GhMLP423

近日，华中农大棉花遗传育种团队在ADVANCED SCIENCE在线发表了最新研究成果。

棉花是主要经济作物，棉纤维是全球领先的纺织原料。随着转基因棉花的广泛采用，编码苏云金芽孢杆菌（BT）毒素的Cry基因已成功控制两种主要的鳞翅目害虫：棉铃虫和红铃虫。然而，目前商业化的转基因BT棉(Cry IAc/Ab)对大多数刺吸式口器昆虫，如粉虱、蚜虫、盲蝽等没有杀虫作用。近年来，刺吸式害虫已成为我国棉田最具破坏性的害虫。根据新疆棉花科研机构2019年的报告，我国棉花主产区-新疆棉区棉田受蚜虫侵害44.2万公顷，约占新疆地区棉花种植面积的20%左右。鉴定棉花抗虫内源基因、开发基因工程新工具具有重要意义，是我国抗虫棉升级的必由途径。因此，棉花功能基因组学需要一种有效且可靠的基因高通量功能分析策略。

功能基因组学研究依赖于大量突变体的筛选；然而，低自然突变率无法满足研究进展的需要。一些传统的实验方法用于植物诱变育种，如物理辐射和化学诱变技术。此外，农杆菌介导的 T-DNA 整合策略彻底改变了植物功能基因组学，通过提供丰富的突变体资源来鉴定基因功能并将许多植物物种的基因型与表型联系起来。然而，T-DNA 插入是随机插入到基因组中的，并且经常整合到基因间或非编码区域中，这可能会产生无法检测到的表型。由于基因冗余，这种现象主要存在于多倍体植物物种中。因此，为具有复杂基因组的多倍体植物物种创建大型或基因组规模的功能丧失突变库是一项艰巨的任务。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统设计了968个sgRNA靶向502个前期通过多重组学鉴定的可能参与棉花抗虫调控的基因（Li et al., Plant Biotechnology Journal,2 016; Li et al., IJMS, 2019; Si et al., Crop Journal, 2020），并快速生成一个约2000株再生植株的高覆盖度突变库。通过高通量测序分析，发现T0代突变体发生基因组编辑的概率达到97.29%，基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。对200个株系进行抗虫测定发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略（如图Ⅰ）。

▲图Ⅰ

为了筛选潜在的棉花宿主昆虫抗性基因，进行了昆虫生物测定，以研究编辑株系对昆虫侵染的反应。总共200 个针对133个基因的独立T1 株系被用于温室和田间条件下的昆虫生物测定。首先，T1代植物在温室中用蚜虫生测实验，而T2代植物在田间条件下进行验证。在温室和田间实验中，有10个株系对蚜虫侵染有显著反应。其中，有两个株系对蚜虫侵染具有较高的抗性，且蚜虫数量明显低于对照植物。另一方面，其他8株系上的蚜虫数量显着高于对照植物，表明对蚜虫的易感性增加（如图Ⅱ）。

▲图Ⅱ

进一步实验发现，这两个株系CR-139和CR-144）检测到相同的针对GhMLP423基因的sgRNA，并且在这两个系中都被成功敲除。有趣的是，这两个品系都对刺吸式口器昆虫和咀嚼式口器昆虫表现出高度敏感，表明GhMLP423可能在棉花抗虫害方面发挥重要作用，因此我们选择它进行进一步研究。以了解其在棉花进化过程中抗虫性中的作用（如图Ⅲ）。

▲图Ⅲ

研究人员针对抗虫性显著下降的GhMLP423基因敲除突变体材料进行了深入研究。实验结果发现GhMLP423与EPS15发生互作，GhEPS15 正向调节植物防御信号(如图Ⅳ)。

▲图Ⅳ

进一步实验发现植物受到昆虫取食时，GhMLP423响应昆虫取食信号，诱导GhEPS15调节Ca2+信号，进一步诱导ROS爆发，这激活了SA和PR相关基因来抵御昆虫取食（如图Ⅴ）。

▲图Ⅴ

综上所述，研究结果表明，GhMLP423是一个伤口响应基因，与GhEPS15一起在植物SAR的调节中发挥积极作用。GhMLP423诱导GhEPS15的表达，进而引发棉花植株损伤诱导的Ca2+信号。Ca2+信号的激活作为第二信使，诱导ROS积累，进而诱导SA和PR蛋白的产生，激活SAR介导昆虫抗性（如图Ⅵ）。

▲图Ⅵ

华中农大博士生孙琳 (目前入职山东省农科院)和博士后Muna Alariqi为该论文的共同第一作者，华中农大作物遗传改良全国重点实验室、湖北洪山实验室PI张献龙院士和金双侠教授为该论文的共同通讯作者。研究工作得到了国家杰出青年自然科学基金、生物育种重大专项、湖北洪山实验室等项目的资助。

油菜团队揭示异源四倍体甘蓝型油菜自交亲和的分子机制

近日，华中农大油菜团队在New Phytologist 发表研究论文，揭示了异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus L.）（AACC）自交亲和的分子机制。

自交不亲和是油菜杂种优势利用的重要途径之一。上世纪70年代，傅廷栋院士通过甘蓝型油菜与白菜（浠水白）杂交，创制了自交不亲和甘蓝型油菜“271”；同时创造性地构建了自交不亲和“三系”（自交不亲和系、保持系、恢复系）育种体系，这是在大田作物应用自交不亲和产生杂种技术上的突破。此外，油菜是由自交不亲和的白菜和甘蓝杂交加倍形成的异源四倍体，其授粉方式已由自交不亲和转变为自交亲和，但其自交亲和的分子机理目前仍知之甚少。因此，深入解析油菜自交亲和形成的分子机制，对促进油菜自交不亲和杂种优势的利用具有极为重要理论及实际意义。

植物的自交不亲和性受复等位的S位点（S单倍型）控制，其遗传机制复杂。以十字花科为例，其S单倍型包含自交不亲和柱头决定因子SRK和花粉识别蛋白SCR。前期研究表明，异源四倍体油菜的A、C亚基因组上各含有一个调控自交不亲和反应的S单倍型。理论上只需一个S单倍型的SRK和SCR具有自交不亲和功能，油菜就应表现为自交不亲和，那么为什么具有两种S单倍型的油菜还是自交亲和的？白菜中的研究表明，在S单倍型杂合的白菜个体中，显性S单倍型内sRNA产生位点（SMI或SMI2）会产生siRNA（Smi或Smi2），抑制隐性单倍型SCR基因的表达。因此，作者推测作为天然S单倍型杂合物种油菜自交亲和性状的形成与可能其S单倍型间的显隐性相关。

为解析油菜S单倍型显隐性是否与其自交不亲和性丢失相关，研究人员通过克隆恢复系‘Westar’A亚基因组BnSMI-1，将其导入到自交不亲和系‘S-70’中，结果发现转基因阳性的‘S-70’株系均由自交不亲和变为自交亲和。这种性状的转变是由BnSMI-1转基因株系BnSCR-1300和BnSCR-6基因启动子区发生高度DNA甲基化，引起BnSCR-1300和BnSCR-6基因表达沉默导致。

▲BnSMI-1转基因株系完全克服‘S-70’自交不亲和性

先前的研究表明BnSMI2-6位点抑制BnSCR-7基因表达，通过基因编辑技术以保持系‘326’为受体创建了油菜自交不亲和系‘SI-326’（Dou et al 2021）。在本研究中，将BnSMI2-1300转入到‘SI-326’中，使‘SI-326’变为自交亲和，BnSMI2-1300转基因株系自交亲和的原因是BnSCR-7基因启动子区发生高度DNA甲基化，引起BnSCR-7基因表达沉默；而BnSCR-6基因启动子区不发生DNA甲基化，其转录不受影响，表明在油菜中BnS-6与BnS-1300单倍型之间不存在显隐性调控关系。进一步的序列分析显示SMI序列广泛存在于十字花科物种；而SMI2序列仅存在于芸薹属物种中，表明二者可能具有不同的起源。此外，研究人员通过恢复系与自交不亲和系、保持系与自交不亲和系互相授粉，发现BnSCR-1300（具有自交不亲和识别能力）与BnSRK-6之间不能引发自交不亲和反应；而BnSCR-6基因过表达株系花粉授到自交不亲和系油菜柱头上发生自交不亲和反应，暗示着BnSRK-6丢失了自交不亲和识别或信号传导能力。

▲BnSCR-6与BnSRK-1300相互识别引起不亲和反应

油菜恢复系与自交不亲和系杂种F1含有BnS-1、BnS-6和BnS-1300三种S单倍型，BnS-1单倍型的SCR基因因启动子上的转座子插入失活，且BnSMI-1产生BnSmi-1抑制BnSCR-6和BnSCR-1300的转录，从而导致杂种F1中三种S单倍型的SCR均不表达，表现为自交亲和。恢复系自交亲和的机理类似于自交不亲和系与其恢复系杂种F1自交亲和的原因。而在自交不亲和保持系中，一方面，由于受到BnSMI2-6产生的BnSmi2-6的抑制，BnSCR-7不能表达，导致BnS-7单倍型不能表现出自交不亲和性；另一方面，BnSRK-6不具有识别BnSCR-6的能力或不能将自交不亲和信号传递，使BnS-6单倍型亦不能表现出自交不亲和性，二者共同导致自交不亲和保持系油菜自交亲和。简而言之，不论是恢复系还是保持系油菜，其自交亲和的原因都是显性S单倍型因各种原因丧失自交不亲和能力，无功能的显性S单倍型通过sRNA沉默有自交不亲和功能的隐性S单倍型，使有功能的隐性S单倍型不能行使其自交不亲和功能，从而导致亲和。

▲油菜自交亲和调控模式图

自交不亲和性的丢失在物种适应性进化中起着至关重要的作用，也广泛存在于十字花科异源多倍体物种中。本研究以自交不亲和“三系”油菜为材料，解析sRNA（Smi和Smi2）在油菜自交亲和进化中的作用，拓宽了人们对十字花科自交不亲和系统遗传基础及其自交不亲和性丢失的理解，也为埃塞俄比亚芥和芥菜型油菜等物种自交亲和机理解析提供借鉴和参考。

华中农大博士后窦胜玮为论文第一作者，作物遗传改良全国重点实验室戴成副教授为论文通讯作者。

文 | 戚杰胡健兵孙琳窦胜玮编辑 | 蒋朝常校对 | 匡敏徐行晏华华转载请按以下格式注明来源↓↓↓