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番茄斑萎病毒侵染的西花蓟马酵母双杂交cDNA文库的构建和分析

花匠小妙招
2024-11-10 21:37

0. 引言

【研究意义】西花蓟马（F. occidentalis）属于缨翅目（Thysanoptera），蓟马科（Thripidae），花蓟马属（Frankliniella），是一种世界性害虫，其寄主范围广泛，食性杂[1]，可通过传播植物病毒病给作物造成重要经济损失，而目前国内外对植物病毒病害的防控仍缺乏有效方法，因此探明病毒在介体昆虫中增殖传毒的关键因子，进而阻断病毒的传播，可为虫传病毒的有效控制提供理论依据。【前人研究进展】20世纪70年代末开始，西花蓟马在北美西部的本土范围广泛传播[2]。随着经济全球化的发展，国际贸易的兴起，特别是花卉贸易加速了西花蓟马的扩散，目前已遍及多个国家和地区，成为世界性的害虫之一[3]。2003年张友军等[4]首次报道其出现在北京市郊某大棚的辣椒上。西花蓟马是一种多食性昆虫，目前已知的寄主植物有66科200余种，包括蔬菜、花卉等重要的经济作物[5]。西花蓟马通过取食植物组织对经济作物产生直接危害[6]，但最大的危害是其传播番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt tospovirus，TSWV）病造成的损失[7]。TSWV属于布尼亚病毒目，主要由西花蓟马以持久增殖型方式传播，TSWV侵染西花蓟马和其他布尼亚病毒侵染哺乳动物类似，可以在介体昆虫的多个器官内增殖[8]。在介体西花蓟马的生命周期中，仅一龄若虫时期和二龄若虫前期能够获取病毒，并且在二龄若虫后期和成虫时期传播病毒[9]。西花蓟马的中肠上皮细胞是TSWV侵染的初始位置，病毒在中肠复制后转移到肌纤维包围的中肠外层肌肉组织并进入到唾液腺[10-11]。在病毒和介体昆虫的互作研究中，越来越多的研究结果表明介体昆虫蛋白在传毒过程中扮演着重要角色[12-13]。有研究结果表明，TSWV糖蛋白GN可以和蓟马中肠发生互作，在介体获毒和传毒中发挥重要作用，并且利用酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid，Y2H）和双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）在西花蓟马一龄若虫鉴定到与TSWV GN互作的6个功能未知蛋白（Cuticular protein-V、Endocuticle structural glycoprotein-GN、Endocuticle structural glycoprotein-V、Enolase、Mitochondrial ATP synthase α-subunit、Cyclophilin），有助于了解介体传毒机制[14]。TSWV非结构蛋白NSs也被报道参与西花蓟马持毒和传毒[15]。因此研究介体昆虫与病毒互作是探究介体获毒及传毒机理的重要前提。【本研究切入点】目前，关于西花蓟马带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建还有待深入研究。【拟解决的关键问题】构建高质量酵母双杂交文库，为筛选西花蓟马与TSWV互作的蛋白及病毒传播的防治提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：西花蓟马系湖南省农业科学院植物保护研究所饲养保存。TSWV毒源由湖南省农业科学院提供，保存于−80 ℃并在本氏烟（Nicotiana benthamiana）上进行扩繁。

试验试剂：大肠杆菌（Escherichia coli） DB3.1感受态细胞、cDNA Library Construction Kit、mRNA纯化试剂盒、CHROMA SPIN TE-1000分离柱、载体pGADT7-Sfi I vector （三框）、Sfi Ⅰ内切酶和T4 DNA连接酶购自TAKARA公司（日本）；Trizol®试剂购自Thermo Fisher Scientific公司（美国）；FastTrack® 2.0 Kit 购自Invitrogen公司（美国）；NucleoBond Xtra Maxi EF购自MN公司（德国）；高级肉汤培养基（Super optimal broth with catabolite repression，SOC）购自全式金试剂销售有限公司（长沙）。

1.2 试验方法1.2.1 带毒西花蓟马群体总RNA的提取和mRNA的纯化

鉴于西花蓟马主要通过一龄若虫获毒，而一龄若虫较小，不易挑选进行饲毒，本试验通过将成虫转移到TSWV侵染的番茄上产卵，48 h后挑取若虫转移到健康四季豆，随机选取10头西花蓟马若虫提取RNA，根据TSWV N基因（GenBank 登录号： JF960235.1）序列设计引物（表1）进行PCR扩增反应，检测西花蓟马带毒率。PCR反应体系为：去离子水19 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，上下游引物（10 μmol·L−1）各1 μL，dNTP Mix（10 mmol·L−1）1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶1 μL，cDNA 2 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸150 s，40个循环，72 ℃延伸5 min。西花蓟马成长为成虫后，利用Trizol®试剂法提取带毒西花蓟马的总RNA，再用DNase I处理提取的总RNA进行DNA的消化，1%琼脂糖凝胶电泳检测。利用FastTrack® 2.0 Kit （Invitrogen）从总RNA中纯化mRNA。琼脂糖凝胶电泳和分光光度计OD260/280检测分离的mRNA质量和浓度。

表 1 引物信息

Table 1. Information on primers

名称
Names引物序列（5′-3′）
Primer sequences（5′-3′） N-FATGTCTAAGGTTAAGCTCACTAAGGAAAN-RTTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGTCpGADT7-FGGAGTACCCATACGACGTACCpGADT7-RTATCTACGATTCATCTGCAGC1.2.2 cDNA的合成和纯化

根据TAKARA公司（日本） SMART cDNA Library Construction Kit操作手册合成cDNA：首先以纯化的mRNA为模板，加入CDS III/3' PCR Primer和SMART IV Oligonucleotide，72 ℃条件下反应2 min，冰上冷却2 min。之后加入5×First-Strand Buffer、dNTP Mix（10 mmol·L−1）、SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase、DTT（20 mmol·L−1），42 ℃条件下合成第一链cDNA。以合成好的第一链cDNA为模板，加入5' PCR Primer、聚合酶Mix、dNTP Mix和CDSIII/3' PCR Prime等进行双链cDNA的PCR扩增，反应条件为：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min，22个循环。扩增的双链cDNA（4 μL）进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率。而后依次用Proteinase K和Sfi Ӏ A/B消化cDNA后，采用CHROMA SPIN TE-1000柱层析法分离纯化双链cDNA。

1.2.3 初级cDNA文库的构建

使用Sfi Ⅰ内切酶酶切酵母载体pGADT7-Sfi I，回收后与经Sfi Ӏ酶切消化的双链cDNA进行连接反应，总体积为20 µL，置于4 ℃条件下反应12 h。取1 µL连接产物电转化入50 µL E.coli HST08 Stellar Electrocompetent Cells感受态细胞内（BIO-RAD's Gene Pulser，1.5 kV，25 µF，200 Ω），电击后迅速向电转杯中加入1 mL SOC培养基，然后迅速转移至无菌的10 mL离心管中，37 ℃下250 r·min−1震荡培养1 h，然后取100 µL培养物分别稀释102、103、104和105倍，涂布于LB/Amp平板。平板37 ℃倒置培养过夜后，使用血球计数板测定文库中总克隆数。测定初级cDNA文库总克隆数cfu：将10 µL转化后的细菌原液（2 mL）稀释103倍，取10 µL涂布于LB平板上，倒置培养过夜，第2天进行计数。总克隆数cfu=（平板上的克隆数/10 µL）×1000倍×2 mL。从平板上随机挑取16个克隆，用表1所列引物进行菌落PCR验证，鉴定cDNA插入片段大小。PCR反应体系如1.2.1中所述。

1.2.4 cDNA文库构建

将剩余19 µL连接产物电转化入大肠杆菌HST08感受态细胞内（1 µL连接产物：50 µL感受态细胞），然后将所有转化产物收集到无菌的50 mL三角瓶中。37 ℃下250 r·min−1震荡培养1 h，然后涂布于12个直径为24 cm的LB/Amp平板，37 ℃过夜培养。平板中加入5 mL LB液体培养基，用玻璃棒将平板上所有克隆收集到2 L三角瓶内，再次加入5 mL培养基收集剩余克隆，将收集到的所有克隆分别转移到两个2 L三角瓶中。首先取10 mL菌液与甘油混合，使甘油含量为20%，保存于−80 ℃冰箱。再取100 µL培养菌稀释102、103、104和105倍后，分别涂布于LB/Amp平板，每个稀释度涂布3个平板作为3次重复。37 ℃过夜培养，血球计数板测定文库滴度和克隆总数，文库滴度=菌落数/（涂布菌液体积×稀释倍数）。最后提取剩余约1.5 L菌液的质粒，用分光光度计测量质粒浓度和质粒总量。

2. 结果与分析

2.1 西花蓟马带毒率检测

随机挑取10头西花蓟马若虫，Trizol法提取总RNA，RT-PCR扩增N基因片段（777 bp），检测西花蓟马带毒率。结果显示10头西花蓟马若虫均检测到N基因片段（图1），仅有一个泳道PCR产物浓度较低，说明TSWV成功侵染西花蓟马，饲毒后的西花蓟马群体带毒率较高，为 90%以上，因此该批次带毒的蓟马可用于构建酵母双杂交cDNA文库。

图 1 西花蓟马带毒率检测

M：DNA marker DL5 000；1–10：饲毒西花蓟马；CK：健康西花蓟马。

Figure 1. Infection rates of TSWV in F. occidentalis

M: DNA marker DL5 000; 1–10: F. occidentalis feeding on TSWV-infected plants; CK: F. occidentalis feeding on healthy plants.

2.2 西花蓟马总RNA提取

提取剩余带毒西花蓟马总RNA。对RNA进行DNase I处理后，1%琼脂糖凝胶电泳显示出28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA的明显条带，并且18S rRNA亮度高于28S rRNA，可能是由于西花蓟马28S rRNA发生隐裂（Hidden break）现象[16]（图2-A）。该结果表明，从西花蓟马中提取的总RNA具有较好的完整性，质量和纯度相对较高，表明提取的RNA可满足建库要求。

图 2 携带TSWV西花蓟马总RNA（A）、合成的双链cDNA（B）纯化的双链cDNA（C）电泳

M: 250 bp DNA Ladder (Dye Plus)；1: 总RNA；2: ds cDNA；3: 纯化后ds cDNA。

Figure 2. Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated from TSWV-infected F. occidentalis (A), synthetic double-strand cDNA (B), and purified double-strand cDNA (C)

M: 250 bp DNA ladder marker (Dye Plus); 1: Total RNA; 2: ds cDNA; 3: purified ds cDNA.

2.3 双链cDNA的合成及纯化

以2 µg mRNA为模板反转录合成cDNA第一链，再以第一链cDNA为模板合成双链cDNA（ds cDNA）。凝胶电泳显示（图2-B），合成的双链cDNA为弥散状且亮度不均匀，表明不同片段大小的cDNA均被有效转录，并且基因转录产物表达丰度不同。通过CHROMA SPIN TE-1000柱层析法去除小片段cDNA，分离纯化大于1 000 bp的cDNA片段（图2-C）。

2.4 初级cDNA文库的构建

将Sfi Ⅰ酶切后的pGADT7载体与ds cDNA进行连接反应，取1 µL连接产物转化入大肠杆菌HST08感受态细胞，并涂布于LB/Amp固体培养基上，37 ℃倒置过夜培养，利用血球计数板检测文库的独立克隆数量。3种读码框初级cDNA文库的库容量分别为3.0×106、2.0×106 和2.0×106 cfu。每个阅读框挑取16个单一克隆进行菌落PCR检测，如图3所示，PCR产物大小0.5～3.0 kb，并随机选取16个单克隆菌液委托北京擎科新业生物技术有限公司测序，经过BLAST比对，均具有同源序列（表2），表明文库具有良好的多态性，符合后续试验要求。

图 3 酵母双杂交cDNA文库插入片段的PCR检测

M: 250 bp DNA Ladder (Dye Plus)；1–16：重组子；A：阅读框1；B：阅读框2；C：阅读框3。

Figure 3. PCR on cDNA fragments inserted in yeast two-hybrid cDNA library

M: 250 bp DNA ladder (Dye Plus); 1–16: Recombinants; A: Reading frame 1; B: Reading frame 2; C: Reading frame 3.

表 2 16个基因序列分析结果

Table 2. Sequences of 16 genes

序号
No.基因名
Gene names片段长度
Length of fragments/bpGenBank登录号
GenBank No. 1未知 Unknown1493XM_0264256122小泛素相关调节剂 Small Ubiquitin-Related Modifier695XM_0264211633类NEDD4-结合蛋白1 NEDD4-Binding Protein 1-like2998XM_0264179194Ras相关蛋白Rab-32 Ras-related Protein Rab-322217XM_026428517540S 核糖体蛋白 S20 40S Ribosomal Protein S20534XM_0264226916类电压依赖性阴离子选择性通道 Voltage-Dependent Anion-Selective Channel-like1392XM_0264164907增殖细胞核抗原 Proliferating Cell Nuclear Antigen1148XM_0264180518类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Fray2 Serine/Threonine-Protein Kinase Fray2-like2491XM_0264314899类热休克 70 kDa 蛋白 14 Heat Shock 70 kDa Protein 14-like1968XM_02641595510相扑偶联酶UBC9 SUMO-conjugating enzyme UBC9875XM_02643579911类左旋酶 Levanase-like2404XM_02643206612类蛋白聚糖4 Proteoglycan 4-like2246XM_0264343731326S 蛋白酶体非 ATP 酶调节亚基 12 26S Proteasome Non-ATPase Regulatory Subunit 121760XM_02643056114胞质Fe-S簇组装因子GI11683 Probable Cytosolic Fe-S Cluster Assembly Factor GI116831652XM_02642140515类氨基磷酸核糖转移酶 Amidophosphoribosyltransferase-like2108XM_02642167116动态肌动蛋白亚基4 Dynactin Subunit 41853XM_0264208372.5 酵母初级文库的扩增

将20 µL连接产物电转化入HST08感受态细胞内，涂布于12个直径24 cm的LB/Amp平板上，同时对培养物稀释102、103、104和105倍，分别取100 µL涂布LB/Amp平板，37 ℃过夜孵育，计算每块平板的克隆数，最终文库库容达到1.5×106 cfu。试验过程中，每个稀释度均涂布3个平板，发现相同处理下文库库容仅相差万个克隆，对数量级影响不大，说明文库能稳定转化。收集所有克隆到2 L的三角瓶中，加入LB液体培养基，37 ℃摇床培养2～3 h，取出10 mL与甘油混合后，−80 ℃保存。剩余培养物进行质粒的大量提取，并通过1%琼脂糖凝胶电泳进行测定，如图4所示。通过分光光度计测定质粒质量浓度为1.0 mg·mL−1，总质量为3.0 mg。

图 4 质粒电泳检测

M1：Lambda EcoT14 I digest；M2：250 bp DNA Ladder marker (Dye Plus)；1: 文库质粒。

Figure 4. Agarose gel electrophoresis of plasmid

M1: Lambda EcoT14 I digest; M2: 250 bp DNA ladder marker (Dye Plus); 1: Library plasmid.

3. 讨论

本研究选择带毒西花蓟马群体，构建酵母双杂交cDNA文库，有利于获得病毒诱导昆虫上调表达的基因序列，为后续研究TSWV与西花蓟马相互作用奠定基础。影响cDNA文库质量的两个重要因素包括RNA完整性和纯度以及cDNA的数量与质量[17]。本研究提取到的昆虫5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA条带清晰，证明RNA无明显降解，虽然存在隐裂现象，但对RNA质量没有影响[16]；同时只采用纯化后片段大小大于1 000 bp的双链cDNA，增加了文库中全长目的mRNA的数量，从而保证所插入cDNA片段的完整性，以满足文库构建要求。

对构建的西花蓟马酵母双杂交cDNA文库进行分析，从库容标准来看，文库的库容量达到1.5×106 cfu （高于文库构建标准的1×106 cfu），保证了文库的覆盖度[18]；从cDNA序列完整性来看，本文库插入片段长度分布在0.5～3.0 kb，保证了西花蓟马cDNA文库重组率[19]，说明所建文库质量较好。此外，由于mRNA翻译成蛋白质是以三联体密码子策略进行编码的，本研究使用SMART技术构建了一个包含3个阅读框的酵母双杂交cDNA文库，与普通cDNA文库相比，插入片段读码框得到有效保证，文库质量更高，能够保证筛选获得有效的介体蛋白[20]。

目前，研究TSWV和西花蓟马的互作都是通过转录组学和蛋白质组学，因为许多蛋白质产物难以基于其同源序列了解其具体功能，通过蛋白之间的互作才有机会进行深入了解，而高通量功能分析能将大量未识别的开放阅读框转化为生物学信息，目前已有研究将高通量测序技术与酵母双杂交技术相结合，用于快速鉴定出大量互作蛋白[21]，酵母双杂交cDNA文库的建立则有助于快速筛选大量互作蛋白，二者结合能有效筛选并鉴定互作蛋白，为了解蛋白功能奠定基础。已有大量研究通过酵母双杂交cDNA文库获得可能直接与昆虫传毒相关的介体蛋白，例如Mar等[22]运用酵母双杂交cDNA文库筛选到白背飞虱（Sogatella furcifera Horváth）体内可能与南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV）互作的153个互作蛋白；Rana等[23]以番茄卷叶病毒（Tomato leaf curl virus，ToLCV）和棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl virus，CLCuV）的外壳蛋白为诱饵，进行烟粉虱（Bemisia tabaci）肠道酵母双杂交cDNA表达文库的筛选，筛选出中肠蛋白（Midgut protein，MGP）与番茄卷叶病毒和棉花曲叶病毒相互作用，并证明MGP参与病毒传播。Ohnesorge等[24]运用酵母双杂交系统筛选到烟粉虱cDNA文库中与番茄黄化曲叶撒丁岛病毒（Tomato yellow leaf curl Sardinia virus，TYLCSV）外壳蛋白（Coat protein，CP）互作的蛋白（BtHSP16）。本研究选用带毒西花蓟马构建cDNA文库，可以直接应用于西花蓟马和TSWV的互作研究，为揭示病毒传播的分子机制提供研究材料。

4. 结论

本研究以携带TSWV的西花蓟马为材料，构建了西花蓟马酵母双杂交cDNA文库。文库库容量较高，可达1.5×106 cfu，平均插入片段分布在0.5～3.0 kb，说明文库质量较好，可用于研究西花蓟马和TSWV之间互相作用关系，探究TSWV侵染过程中介体蛋白扮演的功能，为防治西花蓟马传播病毒奠定理论基础，对进一步防治介体昆虫传播TSWV具有重要的意义。