植物组织培养实验基本步骤

• 花匠小妙招
• 2024-11-10 22:58

植物组织培养实验基本步骤

一、母液的配置

1、MS 大量元素母液的配制

一般将大量元素配制成 10 倍的母液，使用时再稀释 10

倍 。 按 照 配 方 表 中 用 量 依 次 分 别 称 取 扩 大 10 倍的：

NH4NO3 、KNO3 ,KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O

的量，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解

后，最后定容至 1000ml，转入 1000ml 细口试剂瓶中，贴上

标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，

置于 4℃冰箱中保存备用。

2、MS 微量元素母液的配制

一般将微量元素配制成 100倍的母液，使用时再稀释 100

倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 •4H2O、

ZnSO4•7H2O 、H2BO3 、NaMoO4•2H2O、 CuSO4•5H2O、

CoCl2•6H2O 扩大 100 倍的量，用蒸馏水逐个溶解，待全部

溶解后，用容量瓶定容至 1000ml，转入 1000ml 细口试剂瓶

中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制

人姓名，置于 4℃冰箱中保存备用。

3、MS 铁盐母液配制

一般将铁盐配制成 100 倍的母液，使用时再稀释 100 倍。

按照配方表中用量分别称取扩大 100 倍的：FeSO4•7H2O 和

Na2•EDTA•2H2O 的量，把 FeSO4•7H2O 和 Na2•EDTA•2H2O

分别置于 200ml 蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力

搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把 FeSO4 溶液慢慢

倒入 Na2•EDTA 溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，

待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积 1000ml，置于棕色细口瓶

中，用力振荡 1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍

数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令

其充分反应后，再置于 4℃冰箱中保存备用。

4、MS 有机化合物母液的配制

一般将有机化合物配制成 100 倍的母液，使用时再稀释

100 倍。按照配方表中用量分别称取扩大 100 倍的：肌醇、

维生素 B1、烟酸、甘氨酸、维生素 B6 的量，用蒸馏水依次

溶解并定容至 500ml 后，转入 500ml 细口试剂瓶中，贴上标

签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱

中保存备用。

二、植物激素的配置

常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、 萘乙酸（NAA）、

吲哚乙酸（IAA）、 吲哚－3－丁酸（IBA）、 激动素（6-糠氨

基嘌呤、 KT）、 6－苄氨基嘌呤（6－BA）、 赤霉素（GA3）、

1、生长素类：

（1）生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞

的分裂和根的分化，诱导愈伤组织

（2）常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、 萘乙酸

（NAA）、 吲哚乙酸（IAA）、 吲哚－3－丁酸（IBA）。 NAA、

IAA、IBA 被广泛用于生根，2，4－D 有利于愈伤组织的诱

导和生长。IAA 容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时

间不要太久。

（3）溶解方法：用少量 1mol/L NaOH 或 95％酒精预

溶解，再加蒸馏水定容，以前者为好。

（4）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

2、细胞分裂素

组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组

织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配

合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

（1）常用的细胞分裂素有： 6－苄氨基嘌呤（6－BA）、

激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、 玉米素（ZT）、 噻二唑苯基

脲（ thidiazuron、 TDZ ）

（2）溶解方法：用少量（1ml）1mol/L HCL 预溶解，

再加蒸馏水定容。

（3）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

3、赤霉素（GA3）

（1）溶解方法：用少量 95％酒精预溶解，再加蒸馏水

定容。

（2）保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

（3）赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解

（4）灭菌：高温易分解，要过滤灭菌

4、脱落酸

（1）溶解：易溶于 NaHCO3 溶液、氯仿或丙酮。

（2）保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一

定浓度后，冰箱冷藏保存

三、培养基的制备与灭菌

（一）培养基的制备

1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的

各种玻璃器皿等放在指定位置。

2、取烧杯一个内盛 200ml 蒸馏水，按照培养基配方所需

量依次取母液和植物激素加入烧杯，搅拌，按相应培养基称

量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全

融化后加蒸馏水定容至所需体积。

3、充分混合后，用 1mol/LNaOH 和 1mol/LHCl 调节培养

基的 pH 为培养基要求 pH 值。

4、趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。

（二）培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌 20 分

钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是 121℃

（1.06kg/cm2）下灭菌 30 分钟）

1、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分

装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好

温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下

降，待灭菌锅压力表指针降到 0 时，打开排气阀，旋松螺栓，

开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

4、刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，

否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然

冷却。在室温下放置 1-2 天，观察有无微生物生长，以确定

培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。

四、无菌操作技术和接种

1、接种前，用 75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培

养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外

灯及接种房间紫外灯，照射约 30min，然后关闭紫外灯。打

开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风 20min 后，

即可进行无菌操作。（此步由专人统一负责）

2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将

接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约

70mm 长的片段放进 500ml 烧杯中，用蒸馏水冲洗 2 次，倒

掉蒸馏水后倒入 0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约 10

分钟（期间用镊子搅拌几次）。

3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无

菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清

洗 3 次，每次不少于 1 分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全

除去消毒液。

最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一

定大小（花托 0.5cm2、茎段 0.5-1cm）。

4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻

轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。

5、操作完后将镊子等器械浸入 75%酒精中。操作器械需

要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出

后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。

6、将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记

录。

植物组织培养操作的过程

一 生产环境

1 工作人员进入组培室必须穿工作服，包括更换拖鞋、

穿白大褂，接种人员还要带帽、带口罩。

2 所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。

3 工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；

工作人员出入要随手关门。

4 各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱

放。

5 工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，

其内垃圾停留时间不得超过 4 小时。

二 接种程序

1. 准备工作：接种人员在正式接种之前要做好准备工作，

包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用脱脂棉以及准备接种工

具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。

·酒精灯用工业酒精作燃料，而非 75%酒精。

·工作台上用的新洁尔灭浓度是 0.1%，而非 0.01%。

·工作台灭菌包括两步：一是上台前用紫外灯照射 30 分

钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。

·培养皿的取放：从布包里取培养皿时，一定要注意，手

不能接触培养皿的边沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触

面，一般规定只能用双手的拇指和食指取放。

·接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压

锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责完成；二是在工作台上，

从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精灯火焰上

灼烤一遍，其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少

于 5 秒钟。在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕，

都要用酒精仔细擦拭一遍。

2 接（转）苗：包括取苗、切苗和接苗三步。

·取苗：先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取

出其内的全部材料，要先把封口膜（瓶盖）口对者风源放在

酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤 7～10 秒；正式

取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。

·切苗：培养皿放在离风窗 10～20 厘米处，不可太往外；

镊子和手术刀都不可太热，最好是凉的，且在操作过程中，

刀和镊都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切

苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非

迫不得已，不可弄到培养皿外。

·接苗：培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤

方法与取苗时的相同，烤完瓶口后，要先倒掉瓶内多余的水

分，然后在接苗；接苗时，镊子最好不要与瓶口接触，一瓶

内一般接 5～6 棵苗，不要放得太多；组培苗在瓶内要排放

均匀、整齐、美观。

·封口、记录：封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不

动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及

接种日期标示到瓶上。离开之前还要把工作台收拾干净，把

接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。

三 组培苗的管理

1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上，不可乱放。

2.接种人员每天都要统计自己的接种数量，包括转前瓶数

和转后瓶数。

3.值日人员要定时开灯、关灯，保证组培苗有足够的光照

时间，但也不可过长，以每天 14 小时左右为宜。

四 接种用具的清洗

1.洗刷培养瓶、培养皿：第一步：把培养瓶培养皿放入洗

洁净溶液里，先用毛刷清洗内部，再用钢丝球把外面的字清

洗掉。第二步：把他们再用清水冲洗 3-5 遍。第三步：把瓶

内的积水倒掉，倒放在准备台，准备台上要先放一层纱布。

这一步的清洁标准是：凉干的瓶壁（器皿）内外无明显的斑

点、污迹。

2.洗涮镊子：用 洗洁精浸泡五分钟，用钢丝球打磨一下然

后放入清水冲洗三遍。

五 灭菌

1.对污染苗灭菌：一经发现就随即灭菌处理，大量的进行

高压灭菌，少量的加入工业酒精在室外进行处理。

2.室内空气灭菌：每四周用高锰酸钾和甲醛对室内空气灭

一次菌。

3.室内地面：每 2－3 天用新洁尔灭拖一遍地。

4.卧式和手提式高压灭菌锅使用程序：严格按使用说明书

操作。

“植物的组织培养技术”知识归纳及试题

例析

广东省揭东县登岗中学 曾鹏光

一、知识归纳

1、菊花茎的组织培养与月季的花粉培养的比较

选材→材料消毒→接种和培养→

筛选和诱导→移栽→栽培选育

2、植物激素（生长素和细胞分裂素）对实验结果的影响

根据生长素作用的两重性：低浓度促进生

长，高浓度抑制生长，甚至杀死植物

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