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蕙兰种子无菌萌发及植株再生技术探讨

花匠小妙招
2024-11-12 00:14

最近的撕逼神贴太多了，技术贴几乎没有，虽然看着心烦，但奈何自己也没啥本事写出个经验好贴。突然想起之前我写的“老种和组培”帖子中，有很多兰友询问兰花种子萌发和组培相关技术，于是便找了篇蕙兰“大一品”的种子无菌萌发及植株再生技术文章和大家分享一下。文章比较枯燥，喜欢专研的朋友可以相互交流，不喜欢的直接跳过。提前说明，论文内容我做了删减，如果哪位大神有异议，还望轻喷。

1.1材料

人工授粉4个月后尚未完全成熟且未开裂的蕙兰“大一品”蒴果。

1.2培养基的配制方法

1.2.1种子播种基本培养基

种子播种基本培养基选用 1/2ms(ms大量元素减半)，ms，和改良ms培养基(减少原ms大量元素中的氮素),然后分别附加20.0g·l-1蔗糖和7.5g·l-1琼脂,ph=5.8（这里是用三种培养基在做实验，结果是改良培养基效果最好）

1.2.2根状茎诱导和增殖培养基

根状茎诱导和增殖培养基选用改良ms+20.0g·l-1蔗糖+7.5g·l-1琼脂+1.0 g·l-1活性炭为基本培养基，成苗培养基选用ms为基本培养基，p h=5.2～5.5，再添加不同浓度的植物生长调节物质和有机附加物。以上培养基配制好后均常规高压灭菌处理。

1.3外植体处理

蒴果经自来水洗净后，用70%的酒精表面灭菌3 min，再以0.1%的升汞溶液灭菌15min，不需无菌水冲洗，直接将蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分，用解剖刀纵切开，先将种子置于含5ml乙醇+10 ml 10%次氯酸钠溶液+85 ml无菌水的溶液中处理15 min,无菌水冲洗3次后，将种子播种到培养皿中，再用1 cm2的湿润滤纸粘取少许种子均匀播种到种子萌发培养基上。暗培养一段时间，后转移到光下培养。除种子萌发需要暗培养条件外，其余阶段均需光强1600lx,每天光照12h的培养条件。以上培养温度均为(25±2)℃。

1.4无菌萌发的形态学观察

将蕙兰种子灭菌处理后分别接种到不同的萌发培养基上,解剖镜下观察到蕙兰种子呈纺锤形，培养过程中种皮上条纹呈现出褐色。恒温暗培养3个月后，可见培养基上陆续出现白色透明的原球体，白色透明的原球体最初从种子中间部分突破种皮萌发出，转入光下培养，1周后原球茎逐渐转为绿色粒状，解剖镜下观察可见表面密覆白色绒毛，形态已经向根状茎发展。4周后绿色粒状原球茎延长形成明显的绿色分支状根状茎。

1.5培养基对蕙兰种子无菌萌发的影响

蕙兰种子在不同培养基上萌发率有所不同。在ms培养基上种子萌发数较少,并且观察到萌发形成的原球茎生长速度较缓慢，且培养 1 个月后部分萌发后的原球茎褐化死亡；在 1/2ms培养基上种子萌发和生长速度较快，在改良 ms 培养基中种子萌发数量最高，且萌发后的种子生长速度最快，表明改良ms培养基对种子萌发和生长有显著促进作用。而在同样的培养基上随着naa浓度的提高，萌发数也有较大幅度的改变。其中0.5 mg·l-1naa，较适合蕙兰种子萌发，在此浓度下在改良ms培养基上种子萌发数达到了最高，且生长正常。

1.6根状茎诱导及增殖

1.6.1植物生长调节物质对根状茎诱导及增殖的影响

将由合子胚萌发形成的原球茎转移到根状茎诱导及增殖培养基中，两个月后可形成大量分支状根状茎。naa 可有效促进根状茎增殖，且随着naa浓度的升高形成的分支状根状茎越多，但浓度超过2.0 mg·l-1以后,形成的根状茎质脆,不利今后成苗，在单独使用生长素iba的情况下，根状茎形成率明显偏低。

1.6.2有机添加物对根状茎增殖的影响

在培养基中添加了椰子汁、水解酪蛋白和香蕉泥等有机成分，发现均促进了蕙兰根状茎的增殖。研究表明，50 ml·l-1椰子汁为根状茎诱导和增殖阶段的有机添加物效果不错。

1.7根状茎成苗

将根状茎培养在只附加生长素类naa的基本培养基上，根状茎将继续增殖形成分支状根状茎。当将根状茎掰断成2～3 cm长的片段并转移到同时附加一定浓度的6-ba培养基中培养一个月后，根状茎开始形成芽苗，约3个月后芽苗可长至5～8 cm，但此阶段需要适当浓度的ba与naa配合使用。单独使用naa不利于成苗；两者不同的浓度配比产生的成苗效果完全不同。其中在不添加naa而单独添加ba的培养基上,也可成苗，并且随着ba浓度的升高，成苗率逐渐升高；当ba与浓度为0.5 mg·l-1的naa配合使用时,成苗效果较好，当两者浓度分别为ba2.0mg·l-1和naa0.5mg·l-1时每段根状茎成苗数最高为3.6。

兰科植物不同属间原球茎发育成苗的途径不同:一类是原球茎直接形成小苗,或由原球茎增殖形成类原球茎,进而获得大量小苗;一类是原球茎先形成根状茎,再由根状茎顶端分化出芽,形成叶片,进而形成小苗;还有一类是以上两种途径同时存在。本研究通过显微观察了蕙兰种子萌发过程中先形成白色的原球茎,随着进一步的培养,逐渐演变成根状茎形式进行增殖和成苗,看似符合第二类发育途径。

ps：

1、蕙兰无组培的谣言可以说基本已经破灭了。有兴趣的朋友可以尝试，上述实验的成本不会很高，但一定要做好消毒，同时试剂尤其是激素类最好能买进口货，不是崇洋媚外，国内货真的不好用。

2、龙根是**草的重要特征，这个评判标准也在这里受到了质疑。很明显培养基上也可以形成所谓的龙根。这篇论文是种子无菌繁殖，但如果不用种子，用离体组织的话，操作上更简单一些。

3、蕙兰不同品种间萌发及增殖情况差别较大（这是有文献理论支撑的），具体品种尝试时，激素组成和比例都会有一定程度的不同。尝试的朋友如果失败了也别找木舟算账哈，开个玩笑。