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第7讲植物种质资源保存

花匠小妙招
2024-11-12 05:35

1、有第七届植物种质资源保存、种质资源保存方式、广西河池地辖区九万山自然保护区、桂林花坪国家自然保护区、占地面积6.7亩、种茎盆栽保存、围墙、喷灌和遮光设施。目前，果园管理和研究人员共5人，保存了国内外野生稻及其近缘种27种修订4383个资源。国家种质广州野生稻田、中国轻工总会甘蔗糖业研究所海南三亚市崖町海南甘蔗育种场的种质资源田、甘蔗种质资源2003份、水稻种质资源的保存、离体保存的意义、离体保存：短期保存如保存时间长短中期保存一样以保存方式不同的缓慢生长法保存，一般保存：在华中农大用这种方法保存柑橘胚性卡优点：有利于种质交换运输和除细小病毒，随时扩大利用。缺点：保存过程复杂，需要继代培养，

2、不慎，容易与材料污染混淆，且由于连续传代，往往导致遗传变异的发生。慢生长保存法：通过调节培养条件，抑制保存材料的生长，延长传代时间，实现减少操作和劳力的保存方法。具体技术措施： (l )降低培养环境中的氧浓度：如保存材料中添加矿物油(CaPlin 1959；直接减少Bill etal，1989 )或环境中的氧浓度(Engelmann etal，1990 )。例如，在印度蜡芙木的保存中，10和5保存的材料在3个月内相继死亡，用聚丙醇帽代替棉塞封闭试管口，15保存培养物9个月，成活率达到100%。 (2)高渗透保存法：在培养基中加入高渗透物质，提高培养基的渗透压，抑制培养物生长的保存方法。

3、高渗物质：甘露醇、索注音字醇、蔗糖、PEG (分子量6000-8000 )高渗保存配比低温条件效果更好，如6-10低温下，培养基4%甘露醇可以保存马铃薯1-2年，成活率最大可达90%。龙眼愈伤组织： ms1.0mg/l 2，4 d2%甘露醇，延长代替时间从20天延长到35-40天，配合16的低温，可以延长代替时间到60天。 (3)营养调控(饥饿法): 降低培养基中的养分，延缓材料生长速度，达到保存目的。例如，菠萝试管苗与无菌水在1/4MS保存1年，成活率为81%，比完整MS培养基中保存的试管苗活力更强，该技术用于美国Hilo国家无性系资源农田菠萝种的保存。甘蔗顶芽在不添加生长调节剂的1

4、/2MS培养基中于18保存14个月。香蕉茎尖位于仅含核糖的棉花基质中，17次可保存2年。 (4)在培养基中加入一定量的生长抑制剂： ABA、CCC、PP333、B9、叶绿素等，例如在猕猴桃离体保存时，在培养基中加入0.1PPmABA和50PPmB9可以有效地抑制试管苗的生长，在室温下可以保存9个月(郭延平等)。马铃薯试管苗： 4C、MS CCC600mg/L，传代时间从100天左右延长到240天以上。木薯种质资源的离体保存：将试管苗继代培养定在生长抑制培养基中： MS 0.2mg/L NAA 80mg/L Kana 30g/L蔗糖9g/L琼脂，pH=5.8。试管苗能够正常生长保存222

5、4个月以上，是对照(不加Kana )保存时间的1012倍，试管苗根系发达，节间短，茎节数增加，茎棒明显粗，叶色深绿色，温室移植成活率高达90%以上，是对照的58倍。或者加入抗生素，几种方法组合后取得更好的效果： 9低温下，培养基加甘露醇，芋头每3a传代一次，保存时间超过8年，90%以上的培养物保持活力，但其再生率为2年传代材料(Bessembinder etal ) 4MS培养基加多效唑方法离体保存约200个梨品种(Seibi andTakao，1997 )。(5)降低培养温度：用控制温度降低或完全抑制保存材料生长的研究更为普遍。其原理：组织代谢活动随着温度的下降而减弱或完全停止，对于保存

6、冷感性的热带植物，低温保存常常难以进行。常用的温度范围有在常温(1030 )常低温(0-10 )低温(0-80 )极低温(-80以下)、极尺低温保存：-80以下的极低温下保存种质资源的技术方法4种。极低温常用的冷源有干冰(-79 )、极低温冰箱(-80 )、液氮(-196 )和液氮蒸气相(-140 )，极低温保存能够克服常温和低温保存过程中持续发生的遗传变异，并有不同的植物材料如愈伤组织、下胚轴、茎尖、花粉、根尖、芽休眠、原生质体目前已有70多种植物成功地利用芽和茎尖分生组织进行了极低温保存，极低温保存的理论基础(1)细胞球冻结和伤害理论：冻结造成的伤害： 1、细胞球内冻结造成的细胞结构破

7、坏-机械伤害。 2 .使原生质体过度脱水，使细胞球内无机盐浓度上升，破坏蛋白质和酶催化剂的结构，损害膜的完全性，即产生溶液效果。冷冻期间，细胞球间隙的水分比细胞球原生质体中的水分先冻结，即使降低到15的冷冻温度，原生质体也可以维持过冷状态。由于细胞球内过冷却的水分比细胞球外的冰晶具有更高的蒸气压和自由能，细胞球内的水分通过细胞贴壁流向细胞球外，细胞球外的冰晶不断增加，细胞球内的溶液浓度不断上升，这种情况一直持续到细胞球内的水分冻结为止。蔬果组织的冰点和冻结速度受盐类、糖类、酸类等内部可溶性固形物的浓度控制。在缓慢冻结的情况下，冰晶主要形成于细胞球间隙，细胞球内水分不断流出，原生质体中无

8、机盐浓度不断上升，沉淀蛋白质，引起其变性或不可逆凝固，引起细胞球死亡，引起组织解体，质软化。速冻的情况不同。用显微镜观察薄壁细胞组织，如速冻西红柿，发现细胞球内及细胞贴壁存在的冰晶，细胞球间隙不会扩展3v，原生质紧贴细胞贴壁，阻止水分移动，这种微小冰晶对组织架构的影响较小。观察到快速解冻对原生质体的损伤也极微小，质体保存比较完整，液泡膜未受到损伤。完全保持胞质膜结构对于维持细胞球内的静压非常重要，可以防止褐变。冷冻引起的蔬菜水果的组织破坏、软化、汁液等不是低温的直接影响，而是结晶膨胀引起的机械损伤。在云同步，细胞球间隙的冻结引起细胞球脱水，盐水浓度升高，破坏原生质的胶体性，引起细胞

9、球死亡，丧失对新鲜特性的控制能力。如果能够避免极低温保存中细胞球内水分冻结，防止解冻中细胞球内水分再次冻结，就能够达到保存植物材料的目的。方法和技术：进行预处理和加入冻结保护剂，(二)溶液玻璃化理论溶液冻结过程：结晶成核和结晶成核过程后硬化。溶液在降温时，如果没有均匀的结晶核，或者结晶核的生长没有一盏茶的时间，先形成过冷溶液，是冰点下不会结冰的液态。如果降温速度不一盏茶，则形成尖溜溜冰晶的降温速度快于一盏茶，如果均匀核少或几乎未形成，或者没有一盏茶均匀核生长的时间，溶液将进入不定形玻璃化状态，玻璃化状态下细胞球内分子不会重排，溶液效应不会对细胞球造成损伤，细胞球内冻结将受到机械损伤影响

10、超低温冷冻保存的因素：预处理方法和技术冷冻降温速度保存时间材料的性质和特征冷冻保护剂的种类及其浓度，作为冷冻保护剂应具有以下特性：分子量小则易与溶剂混合，可以快速渗透到细胞球中无毒或毒性小则易溶出，按保护剂的功能和性质分类的分类：冻结保护剂：冻结和干燥过程中活性成分改性的物质，例如甘油、二甲基亚砜填充剂：防止有效成分与水蒸气一起热升华而逸散，可以使用甘露醇、乳糖，能够形成动物胶等有效成分的物质抗氧化剂：防止植物组织和细胞球在冻结干燥过程和储藏过程中发生氧化变质的物质，例如维生素d、维生素e、维生素c、蛋白质水解作用物、硫代硫酸钠金属钍等酸碱调节剂：在冻结干燥过程和储藏过程中，能够将生物制

11、品的pH值调整到活性物质最稳定区域的物质，例如磷酸、索注音字醇、EDTA (乙亚胺四冰乙酸二纳米)、氨基酸等。冷冻保护剂的作用： (1)促进冰点降低、过蒸发制冷和“玻璃化”状态的形成。 (2)增加胞质膜渗透性，加快水分外渗。 (3)提高溶液粘性，阻止冰晶的形成。 (4)稳定细胞球内大分子的构造，防止低温对膜的损伤。常用的小分子冷冻保护剂：蔗糖、海藻糖、脯氨酸、甘油DMSO甘露醇、索注音字醇(通常为填充剂)等。另外，聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、牛血清(BSA )、右旋糖酐(dextran )、聚乙烯管二醇(PEG )等高分子聚合物也具有保护作用。聚合物类保护剂的作用和特点：提高冻结过程中

12、优先析出的具有一定表面活性的蛋白质分子间产生空间阻碍作用的溶液的黏性系数，显着提高玻璃化转变温度，抑制蔗糖等小分子的结晶，抑制溶液的pH降低。保护剂浓度对保护效果的影响，特氟里肌肉浓度对磷酸果聚糖激酶(PFK )的冷冻干燥保护效果的影响，极低温保存常用方法：玻璃化法包埋脱水法玻璃化法的特点：冷冻前，使用高浓度冷冻保护剂，用25或o进行有会儿处理，诱导组织脱水，直接浸泡在液氮中，液氮包埋/脱水法：参照人工种子技术，根据低温保存需要将包埋和脱水结合，用于极低温保存. 具体方法是将茎尖用藻朊酸盐包埋，在含高浓度蔗糖的培养基中预培养后，用通风箱处理26h或用硅凝胶处理，空气蒸发脱水后进行极低温保存

13、。包埋/脱水法的优点：操作简便，脱水过程较慢，一次可处理多种材料，避免使用对细胞球有毒的冻结保护剂。缺点：部分植物成苗率低，与玻璃化法相比组织恢复生长慢，脱水需要时间长。极低温保存后细胞球和组织活力检测的根本方法：再培养染色法： FDA、酚藏花红、TTC、王永林等试验：将马铃薯试管苗放在10mm的茎尖，用MS 5%DMSO的培养基预培养3-4天，切取2-3mm的茎尖，制成冻结保护剂(30%(W/V )甘油11 用六乙二醇15%(W/V )二甲基亚砜0.4 mol/L蔗糖)在室温下处理2030分钟，放入液氮中冻结10分钟。在37水浴中快速解冻2分钟，用MS 1.2 mol/L蔗糖液体培养

14、基洗涤2次，每次10分钟后进行恢复培养，茎尖成活率为38.7%至42.5%。 60分钟内冷冻时间对成活率无显着影响。荔枝胚愈伤组织冷冻保存：从郭玉琼提取的博士研究生论文预处理： 1，预培养：荔枝胚愈伤组织生长15d后，转送到ms50ml/ldmsolmg/l2、4d20g/l蔗糖6g/L琼脂糖的预培养基。2 .冻结保护剂预处理：将预培养的胚性愈伤组织转移到1.8mL专用冻结保存管中，每管含有0.39g胚性愈伤组织，常温下用60%玻璃化溶液(2PVS2)处理20min。再用0玻璃化溶液(PVS2)溶液平衡40分钟。去除PVS2溶液，加入新鲜PVS2保护剂，3、冷冻保存：将冷冻管迅速投入液氮中保存1周。 4、解冻和恢复培养，愈伤组织成活率从28.46%到36.31%。冷冻保护剂： PVS2:Ms 0.4moL/L蔗糖30%甘油l5%六乙二醇l5%DMSO 2PVS2:0.15mol/L蔗糖液体培养基PVS2溶液体积比40:60，解冻方