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快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-12 06:01

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，更具体地说，本发明涉及文心兰种苗的凤仙花坏死斑病毒的检测方法。

背景技术

文心兰又名跳舞兰、金碟兰，是多年生草本花卉，原产中南美洲和北美洲南部。以花色鲜艳，花型丰富而成为世界上重要的兰花品种之一。现世界各地均有栽培。随着兰花种植范围的扩大和无性繁殖技术的应用，兰花上的病毒病的发生也日趋严重。已报道感染兰花的病毒病达27种，其中文心兰上常见的病毒病是建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。目前的研究主要集中在这两种病毒检测上。近几年，番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒在我国台湾和云南的兰花上出现，引起兰花叶片环斑，黄化。兰花的观赏价值和经济价值遭到了严重影响。研究初步确定为番茄斑萎病毒属病毒但没有鉴定到种。

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，番茄斑萎病毒属中发现的第二个病毒，传播介体为西花蓟马，是番茄斑萎病毒属中寄主范围较广，危害较大的病害。可侵染50 个科300多种植物，其中观赏植物占39个属、蔬菜占6个属，包括马蹄莲、菊花、唐菖蒲、黄瓜、辣椒和莴苣等常见花卉和重要经济作物。ISNV引起的症状多样，随寄主和侵染时期不同而变化，主要表现为矮化、环斑、叶片或茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐(溃疡)、碎色花，甚至植株死亡。

综上所述，文心兰是兰花产业中主要的品种之一，侵染兰花的病毒种类多，且目前研究主要针对常见的几种兰花病毒病害。另外，凤仙花坏死斑病毒因寄主范围广，传播介体个体小，传播速度和繁殖速度快的特点易对兰花产业造成严重危害，这是一个迫切需要解决的技术难题。现有技术中尚未发现相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，填补凤仙花坏死斑病毒检测方面的空白，提供快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明提供了快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法，包括下述顺序的步骤：

(1)运用上海华舜的植物叶总RNA提取试剂盒从表现同心圆褪绿斑症状的文心兰叶片上提取植物总RNA；

(2)利用凤仙花坏死斑病毒的特异性引物ZI2R把提取到的总RNA反转录成cDNA；

(3)运用合成的cDNA，分别以特异性引物ZI2F/ZI2R和ZI1F/ZI1R进行扩增，建立常规的PCR检测方法；

(4)对ZI1F/ZI1R扩增的PCR产物再分别以ZI1F/ZI3R、ZI3F/ZI1R、 ZI3F/ZI3R为内引物进行二次扩增，建立巢式PCR检测方法。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

首次在文心兰植株上检测到凤仙花坏死斑病毒，也是首次在中国发现该病毒，建立了凤仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR的检测方法。与常规的生物学方法相比，本发明的检测方法具有灵敏性高，特异性好等优点，本发明中提到的特异性引物及PCR反应体系和反应程序能扩增出与预期片段大小一致的目的条带。特别是当病毒含量少时，使用巢式PCR能在灵敏性和特异性方面比常规RT-PCR有进一步的提高。本发明建立凤仙花坏死斑病毒的检测方法对及时防治病毒对植株的侵害提供了有效的检测手段。

附图说明

图1受病毒侵害的文心兰上的症状；其中，(a)初期表现出褪绿圆斑 (b)逐渐表现出同心圆退绿斑(c)后期变成褐色坏死斑块；

图2RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，1.表现症状的病斑处样品 2.表现症状的远离病斑处的样品 3.与病斑邻近的叶片 4.健康植株对照；

图3N基因上539bp序列比对聚类图；

图4巢式PCR；其中，1：ZI1F和ZI3R扩增产物；2：ZI3F和ZI1R扩增产物；3：ZI3F和ZI3R；

图5常规PCR与巢式PCR灵敏性；其中，1-6：依次为1、10、10-2、 10-3、10-4、10-5倍稀释后的常规PCR；7-12：依次为1、10、10-2、10-3、10-4、 10-5倍稀释后的巢式PCR。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本实用新型作进一步详细描述。但它并不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

——RT-PCR检测

从感病植株表现症状的部位、远离症状的叶尖和健康植株上取样，提取植物总RNA，合成cDNA后分别以ZI2F和ZI2R作为特异引物进行常规PCR扩增。PCR反应体系25μL：上述反转录产物2μL、10×PCR Buffer 3μL、 Mg2+(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(各2.5mM)0.4μL、ZI2F0.4μL、ZI2R 0.4 μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL和灭菌水17.4μL。反应程序：94℃5min； 94℃ 30s、45℃ 30s、72℃ 40s，30个循环；72℃ 8min。

RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2，表现症状的叶片上经PCR扩增后，在500bp处可以看到与预期片段大小一致的目标条带 (见图2，泳道1，2)。从未表现症状的叶片上也扩增出与预期片段大小一致的目标条带(见图2，泳道3)。而阴性对照没有特异性扩增条带。(图2，泳道4)

利用大连宝生物公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接于 pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性菌落，所得重组质粒经酶切验证后，送大连宝生物公司测序。测序结果表明重组质粒插入片段全长为539bp，BLAST序列分析该片段的核苷酸序列与已经报道的 INSV核苷酸序列同源性为99％。利用DNAMAN5.2.2软件对不同地区样品N基因上的539bp序列分析发现，在所扩增的区域中国云南文心兰上INSV的分离物(KMS6503)与日本、意大利的分离物(GenBank登录号为AB109100、 Ab207803和DQ425096)同源性为99％，与美国、荷兰的分离物(GenBank登录号分别为D00914、DQ523597、DQ523598和X 66972)同源性为98％(见图3)。序列聚类结果表明中国云南文心兰上发现的INSV可能是由日本、意大利传过来的。

实施例2

——巢式PCR检测

以ZI1F和ZI1R为外引物进行第一轮PCR扩增，扩增产物分别以ZI1F 和ZI3R、ZI3F和ZI1R、ZI3F和ZI3R为内引物进行第二轮扩增。模板2μL、 10×PCR Buffer 3μL、Mg2+(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(各2.5mM)0.4μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL和灭菌水17.4 μL。反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 40s，30个循环； 72℃ 8min。

同时将cDNA以10倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍稀释后先用引物ZI1F 和ZI1R进行第一轮扩增，然后以ZI3F和ZI3R为引物进行第二轮扩增来验证巢式PCR的敏感性。

1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示ZI1F和ZI3R扩增片段850bp；ZI3F和 ZI1R 452bp；ZI3F和ZI3R 338bp(见图4)。cDNA浓度梯度稀释进行常规PCR 和巢式PCR电泳结果显示巢式PCR能检测到10-3倍(见图5)。1-6：依次为1、 10、10-2、10-3、10-4、10-5倍稀释后的常规PCR，7-12：依次为1、10、10-2、10-3、 10-4、10-5倍稀释后的巢式PCR

所述的特异性引物为：

ZI1F：5′-TATTTCACACGCAAACCCTT-3′；

ZI1R：5′-GATGAACAAAGCAAAGATTACC-3′；

ZI2F：5′-GTTTAGCCTTACCAAT-3′；

ZI2R：5′-TACCAACAACCGTGAA-3′；

ZI3F：5′-CTAAGAGAACACCCAAGACA-3′；

ZI3R：5′-TACCAACAACCGTGAAAAGA-3′。