基于纳米孔测序技术的植物病毒快速检测与应用研究
基于纳米孔测序技术的植物病毒快速检测与应用研究
【摘要】： 植物病毒分布广、繁殖快、防治难,素有植物“癌症”之称。全世界每年因植物病毒造成的农业损失占粮食作物总产量的10%,其流行和爆发严重威胁着粮食生产和人类食品安全。因此,建立准确、灵敏、低成本的植物病毒检测方法,对于预防植物传染性疾病的扩散,保证粮食生产安全具有重要的意义。近年来随着农业现代化、全球化的不断发展,植物病毒呈现新发生、再发生和复合发生的特点,给植物检疫部门及农业生产单位的植物病毒快速检测能力提出新的要求。牛津纳米孔技术公司(英国,牛津)研发的纳米孔测序技术(Nanopore)是一种新型的测序平台,它具有速度快、读长长、设备便携性以及数据实时处理等特点,为植物病毒现场快速检测提出新的应用模式。为探索该技术在植物病毒快速鉴定中的应用,本研究开展了基于纳米孔测序技术的植物病毒快速检测的相关研究,建立了针对植物检疫性病毒的多目标靶向测序技术方案,单次测序可实现对15种检疫性病毒的快速检测;建立了针对未知病毒的非靶向测序技术方案,成功在苦楝树样品中鉴定到一种新的植物杆状DN A病毒。此外,本研究基于该新病毒的基因组信息,建立了基于环等温介导扩增的核酸横向流试纸条检测技术,为该病毒的早期检测提供技术保障。主要结果如下:1、检疫病毒的多目标靶向测序技术方案利用所有植物病毒均能产生RNA的特点,将特异性多重反转录技术与纳米孔c DNA测序技术相结合,针对检疫病毒多目标检测方法。通过获取我国32种植物检疫病毒基因组信息,根据其结构特点,设计特异性引物与特异性反转录引物池;通过体外转录技术获得15种检疫病毒RNA核酸样品,建立植物病毒复合侵染模型,并利用该模型对基于纳米孔测序技术的已知病毒多目标检测方法进行灵敏度、特异性评估。结果显示,在病毒核酸含量低至0.05%的样本中,测序1 h即可获得全部待测病毒信息,平均测序覆盖度为227×。选择检疫病毒检出率较高的玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)、马铃薯帚顶病毒(Potato mop-top virus,PMTV)、南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)及马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)为研究对象,进行实际样品的检测验证,结果表明:利用建立的多目标靶向测序技术方案,在测序20 min即可获得全部待测病毒信息,平均测序覆盖度为155×。2、未知病毒的非靶向测序方案为探索纳米孔测序技术在未知病毒的应用,对疑似病毒感染的毛豆(Glycine max(Linn.)Merr.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、苦楝树(Melia azedarach L.)植物样品的总RNA进行末端加Poly A后进行c DNA扩增建库测序,10 h后获得6 G数据。通过Blast程序将测序数据与病毒数据库进行比对,发现毛豆主要受花生斑驳病毒(Peanut mottle virus,PMo V)侵染,基因覆盖度为85.6%,与参考序列相似性达99.4%。辣椒主要受黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染,CMV RNA3、CMV RNA1、CMV RNA2三条基因组的覆盖度分别为99.4%、99.8%、99.1%,相似性分别达97.5%、99.4%、99.5%。在苦楝树样品中鉴定到一种与可可肿枝病毒(Cacao swollen shoot virus,CSSV)具有较高相似度的新种植物杆状DNA病毒(基因覆盖度12.4%、相似性80.4%)。经PCR扩增获得该病毒全长基因组序列,进化分析显示该病毒与可可肿枝病毒L(Cacao swollen shoot Ghana L)具有70.8%序列相似性,暂时命名为苦楝树杆状病毒1(Chinaberry tree badnavirus 1,Ch TBV1),该病毒的发现对基于纳米孔测序技术在未知病毒的快速检测中的应用提供应用示范。3、建立基于LAMP-LFD技术的苦楝树杆状病毒1的快速检测将环介导恒温扩增技术与核酸横向流试纸条检测技术相结合,建立了一种快速鉴定苦楝树杆状病毒1的LAMP-LFD可视化检测方法。根据Ch TBV1的ORF3基因设计5条LAMP引物和1条异硫氰酸荧光素标记探针。同时对各主要反应条件:包括反应温度、反应时间、聚合酶浓度、Mg SO_4浓度等进行优化,结果显示,该技术的灵敏度是常规PCR方法的100倍,研究建立的LAMP-LFD检测方法可作为早期诊断和检测Ch TBV1的有效手段。
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2022
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