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南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

花匠小妙招
2024-11-12 06:02

江西农业学报"##$%&$’()’*+,-.+/01,23-20.451.6/71南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究吴兴海邵秀玲张凤娟王英超陈长法

肖西志收稿日期"##$8#(8#9基金项目国家质检总局植物病原检测专项基金"##*:;#99。山东出入境检验检疫局山东青岛"99##"摘要根据南芥菜花叶病毒!"#$%&’(&#%)*+,(-%".&/0基因序列设计并合成了特异性<=8>?<检测引物对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了>?<扩增反应。结果南芥菜花叶病毒的感病植物组织的>?<产物均出现’9(@A的特异性扩增条带而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总<B+做梯度稀释测定该检测体系的敏感度结果表明此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的<B+模板浓度为%*#A/C!D。关键词分子生物学南芥菜花叶病毒快速检测中图分类号E(%"文献标识码+文章编号%##%8F*F%"##$#$8##’(8#"!"#$%&’()*+$,-"-."+&’&/!"#$%&’(&#%)0-*&1+2#34%5&6-.#6)27+&6&8+.)65-"9&$GHI16/8J.1EK+LI128316/MB+BNO46/8P2.6G+BNQ16/8,J.R?KSB?J.6/8T.I:+LI18UJ1EJ.6VR6/S71-8S6-0W:6XA4,-1R6.6VY2.0.6-164Z204.2Y16/V.R"99##"?J16.:43"2)."EA4,1T1,A01[40XJ1,J404V4X1/64V@.X4VR6-J4X4]246,4RT?>/46416+0^_@W<=8>?<4042X4VTR0>?<04‘.,-1R6RTA3.6--1XX241-J+0^_.6V6R68+0^_R63W-J4A3.6--1XX241-J+0^_J.V-J4XA4,1T1,.[A31T1,.-1R6RT.’9(@AaB+A0RV2,-b=J4A01[40.XXA4,1T1,-R+0^_b=J4<B+XR32-1R6RT+0^_.XV132-4V@W/0.VX-RV4-40[164VX46X1-1c1-WRT-J4XWX-4[b=J434c43RTV4-4,-1R631[1-RT-J4A01[40.X%*#A/C!Db;-%<&2$3>?<!"#$%&’(&#%)B4ARc102X+0^_<.A1VV4-4,-1R6南芥菜花叶病毒!"#$%&’(&#%)B4ARc102X寄主范围广泛可侵染植物种类达约%$(属、"%*种。主要危害大豆、黄瓜、胡萝卜、草莓、白菜水仙、郁金香等多种经济及园艺植物。其地理分布极广芬兰、日本、澳大利亚、希腊、美国、以色列、匈牙利等国的作物生产都曾因其导致的植物花叶病而受到重大损失属于世界性病害。《中华人民共和国进境植物检疫潜在危险性病、虫、杂草名录》规定南芥菜花叶病毒属二类有害生物是所有进出境苗木必须实施的检疫项目。口岸检疫过程中南芥菜花叶病毒的检疫鉴定一般在传统的目测法、免疫荧光电镜观察法、血清学鉴定等步骤后还需进行指示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂时间冗长甚至超出苗木存活容许的时间范畴等缺陷给检疫工作的顺利实施开展造成了一定的困难已无法满足口岸检疫的需要。为解决传统植物病毒检测方法周期长、灵敏度低等问题本研究建立了一套快速检测南芥菜花叶病毒的分子生物学方法。=材料与方法=?=材料和试剂%b%b%材料南芥菜花叶病毒!"#$%&’(&#%)B4ARc10‘2X毒株由检验检疫科学院研究所提供烟草花叶病毒由西北农林科技大学植保学院提供番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒和接种植物烟草为我室保管。%b%b"试剂反转录酶+^_、=.]聚合酶购自上海生物工程有限公司aB+^.0d40、VB=>为宝生物工程有限公司大连公司产品。=?@南芥菜花叶病毒感病植物组织及健康组织(0:的提取用注射法使南芥菜花叶病毒感染烟草种苗%)"周后叶片上的感染部位形成花斑状组织。切取植株的感病组织、健康组织提取总<B+备用。提取方法可参照《分子克隆实验指南》第三版植物总<B+提取法。=?A引物设计与合成根据B?Z:基因库的南芥菜花叶病毒不同株系的/0基因序列利用计算机软件>01[40*b#设计其<=8>?<扩增简并引物序列为+%+++N=NN+=?+??N?=NN++"=N?=N??=?+++?=?+N?+=引物合成由上海闪晶生物工程有限公司完成。=?B(CDEF(扩增反应%b(b%一步法<=8>?<扩增体系反转录酶+^_"#H%#eZ2TT40*!D"b*[[R3CDVB=>(!D*HC!D=.]aB+聚合酶#b9!D上、下游引物各"!D%#A[R3C!D<B+模板(!D无菌超纯水补充至*#!D。%b(b">?<循环参数(*f反转录合成,aB+第一链