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加强生物固碳的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-12 12:32

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310751205.9 (22)申请日 2013.12.31 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 103911401 A (43)申请公布日 2014.07.09 (30)优先权数据 61/749,010 2013.01.04 US (73)专利权人财团法人工业技术研究院地址中国台湾新竹县竹东镇中兴路四段 195号 (72)发明人陈昌杰郭欣慈周宜德徐勤祯吴韶文 (74)专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司 11006 代理人徐金国 (51。

2、)Int.Cl. C12P 7/54(2006.01) C12P 7/52(2006.01) C12P 7/40(2006.01) C12P 7/06(2006.01) C12P 7/28(2006.01) C12P 7/04(2006.01) C12P 7/16(2006.01) C12P 7/18(2006.01) C12R 1/145(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 Michael Kopke et al.2,3-Butanediol production by acetogenic bacteria, an alternative route 。

3、to chemical synthesis, using industrial waste gas. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY .2011,第77卷 (第15期),5469-5470,5473. WILLIAM E.BALCH等.Acetobacterium,a new genus of hydrogen-oxidizing,carbon dioxide-reducing,Anaerobic Bacteria. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY .1977,第27卷(第4期),摘。

4、要，表 1，图3,355页右栏最后1行至356页左栏第1行. WILLIAM E.BALCH等.Acetobacterium,a new genus of hydrogen-oxidizing,carbon dioxide-reducing,Anaerobic Bacteria. INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY .1977,第27卷(第4期),摘要，表 1，图3,355页右栏最后1行至356页左栏第1行. 审查员刘红霞 (54)发明名称加强生物固碳的方法 (57)摘要由微生物发酵方法产生选自酸和醇的至少一种产物，。

5、包括：向微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包括乳酸和/ 或其盐，且其中所述气体底物包括选自CO和CO2 的至少一种碳源；以及使微生物产生选自酸和醇的至少一种产物。权利要求书2页说明书9页附图5页 CN 103911401 B 2018.08.31 CN 103911401 B 1.乳酸和/或其盐在用于提高微生物发酵包括CO2的气体底物的效率中的应用，所述应用包括：向微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包括乳酸和/或其盐，且其中所述气体底物包括CO2，其中该乳酸和/或其盐诱导与CO2固定相关的基因的表达，以及使所述微生物。

6、产生选自酸和醇的至少一种产物，其中相对于不存在乳酸和/或其盐的条件下培养的微生物，所述乳酸和/或其盐存在的量足以诱导选自codH、 codH 、 codH 、 codH、 coos1和metF的至少一种基因增加表达约1.5 倍或以上，其中所述乳酸和/或其盐是以0.5g/L至3g/L的浓度存在。 2.如权利要求1所述的应用，其中所述气体底物进一步包括选自H2、 N2和CO的至少一种气体。 3.如权利要求1所述的应用，其中所述气体底物包括至少20体积的CO2。 4.如权利要求1所述的应用，其中所述至少一种产物选自乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸和脂肪酸。 5.如权利要求1所述的应用。

7、，其中所述至少一种产物选自乙醇、丙醇、丁醇和2,3-丁二醇。 6.如权利要求1所述的应用，其中所述微生物能够将CO2和/或CO转化为选自酸和醇的至少一种产物。 7.如权利要求1所述的应用，所述微生物选自醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum) 、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热乙酸穆尔氏菌(原热乙酸梭菌， Moorella the。

8、rmoacetica， Clostridium thermoaceticum)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、自养脱硫杆菌(Desulfobacterium autotrophicum)、斯蒂克兰德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、嗜热自养梭菌(Clostridium thermoautotrophicum)、蚁酸醋酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲醇醋酸杆菌 (Acetobacterium carbinol。

9、icum)、凯伍醋酸杆菌(Acetobacterium kivui)和伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)。 8.乳酸和/或其盐在提高微生物发酵中碳捕获效率中的应用，包括：向微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包括乳酸和/或其盐，且其中所述气体底物包括选自CO和CO2的至少一种碳源，且其中该乳酸和/或其盐诱导与CO2 固定相关的基因的表达，和使所述微生物产生选自酸和醇的至少一种产物，其中相对于不存在乳酸和/或其盐的条件下培养的微生物，所述乳酸和/或其盐存在的量足以诱导选自codH、 codH 、 codH 、 codH、 coos。

10、1和metF的至少一种基因增加表达约1.5 倍或以上，其中所述乳酸和/或其盐是以0.5g/L至3g/L的浓度存在。 9.如权利要求8所述的应用，其中所述气体底物进一步包括选自H2和N2的至少一种气权利要求书 1/2 页 2 CN 103911401 B 2 体。 10.如权利要求8所述的应用，其中所述气体底物包括至少20体积的CO2。 11.如权利要求8所述的应用，其中所述至少一种产物选自乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸和脂肪酸。 12.如权利要求8所述的应用，其中所述至少一种产物选自乙醇、丙醇、丁醇和2,3-丁二醇。 13.如权利要求8所述的应用，其中所述微生物能够将CO。

11、2和/或CO转化为选自酸和醇的至少一种产物。 14.如权利要求8所述的应用，所述微生物选自醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、难辨梭菌(Clostridium difficile)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热乙酸穆尔氏菌(原热乙酸梭菌， Moorella thermoacetica， Clostridium thermoaceticum)，嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacte。

12、rium thermoautotrophicum)，自养脱硫杆菌(Desulfobacterium autotrophicum)，斯蒂克兰德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、嗜热自养梭菌(Clostridium thermoautotrophicum)、蚁酸醋酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲醇醋酸杆菌 (Acetobacterium carbinolicum)、凯伍醋酸杆菌(Acetobacterium kivui)和伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woo。

13、dii)。权利要求书 2/2 页 3 CN 103911401 B 3 加强生物固碳的方法 0001 本申请要求享有2013年1月4日提交的美国临时申请No.61/749,010的优先权。技术领域 0002 本发明涉及一种加强生物固碳的方法。背景技术 0003 最近的气候异常，包括飓风和干旱已与全球变暖即全球温度上升有关。全球变暖的一个主要原因是由于大气中二氧化碳浓度的增加。事实上，据报道在过去200年里大气中 CO2浓度已从大约280ppm上升到368ppm。因此，开发能够有效减少CO2排放或从大气中捕获 CO2的方法是人们一直感兴趣的。 0004 利用有机体将CO2转化。

14、为有机化合物的方法通常被称为二氧化碳生物固定。二氧化碳生物固定最突出的例子包括使用光合微生物，如微藻和蓝藻，其运用太阳能驱动碳固定途径。 0005 除了光合微生物以外，化能自养微生物（chemoautotrophic microorganisms）（一类通过无机化合物氧化而不是光合作用获得其营养的微生物）代表了用于碳固定方法的一种潜在替代物。 0006 化能自养微生物使用的一个主要的非光合二氧化碳固定途径是Wood-Ljungdahl （WL）通路（图1）。 WL通路通常为厌氧微生物所用，包括醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、自产乙醇梭菌。

15、（Clostridium autoethanogenum）、食氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）、难辨梭菌（Clostridium difficile）、杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、热乙酸穆尔氏菌（原热乙酸梭菌， Moorella thermoacetica， Clostridium thermoaceticum）、嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）、自养脱硫杆菌（Desulfobacterium autotrophicum）、。

16、斯蒂克兰德氏梭菌（Clostridium sticklandii）、嗜热自养梭菌（Clostridium thermoautotrophicum）、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、大梭菌（Clostridium magnum）、甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum）、凯伍醋酸杆菌（Acetobacterium kivui）和伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）。 0007 尽管一些产乙酸梭菌已被工程化用以生产大宗化学品（例如丁酸盐、醋酸盐、乙偶姻和丙酮）。

17、和生物燃料（例如丁醇和乙醇），但仍然需要开发可提高厌氧有机体将CO2代谢为有用化学物质和/或生物燃料能力的方法。发明内容 0008 因此，本发明提供用于微生物发酵包括CO2的气体底物的方法，所述方法包括： 0009 向微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包括乳酸和/或其盐，并且其中所述气体底物包括CO2，和 0010 使微生物产生选自酸和醇的至少一种产物。说明书 1/9 页 4 CN 103911401 B 4 0011 本发明还提供一种提高微生物发酵中碳捕获效率的方法，包括： 0012 为微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包。

18、括乳酸和/或它们的盐，且其中所述气体底物包括选自CO和CO2的至少一种碳源，和 0013 使微生物产生选自酸和醇的至少一种产物。 0014 本发明其他的特征和优点将在本说明书下文部分进行阐述，并且有些部分在说明书中是显而易见的，或者可通过本发明的实践来获知。通过附属的权利要求书中特别指出的要素和组合可以认识到或得到所述特征和优点。 0015 应当理解的是，以上一般说明和以下详细说明都仅是示例性和说明性的，不是对所要求保护的本发明的限制。 0016 附图显示了本发明公开的示例性实施方式，将其纳入并构成本说明书的一部分。附图说明 0017 图1显示了Wood-Ljungd。

19、ahl （WL）通路。 0018 图2显示了暴露于CO2和H2的混合气体中的杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii） BCRC17797的生长曲线，（a）实验组（培养基中含有2.5g/L的乳酸钠），（b）钠离子对照组（培养基中含有1.52g/L的NaCl），和（c）无添加剂对照组，如实验例部分所述。 0019 图3显示了培养基中存在2.5g/L乳酸钠可诱导乳酸通透酶和Wood-Ljungdahl通路中涉及的某些基因。如实施例部分所述，其表达与无添加剂对照组相比有成倍的增加。 0020 图4显示了培养基中存在2.5g/L乳酸钠可诱导乳酸通透酶和W。

20、ood-Ljungdahl通路中涉及的某些基因。如实施例部分所述，其表达与钠离子对照组相比有成倍的增加。 0021 图5显示了相对于无添加剂对照组，两个实验组（1g/L和2.5g/L的乳酸钠）中某些基因的表达，如实施例部分所述。 0022 图6显示了培养96小时后，实验组、无添加剂对照组（只有合成气）和钠离子对照组中醋酸的产量，如实施例部分所述。 0023 图7显示了培养96小时后，实验组、无添加剂对照组（只有合成气）和钠离子对照组中乙醇的产量，如实施例部分所述。 0024 图8显示了培养90小时后，相对于无添加剂对照组，包含1g/L乳酸钠的实验组中。

21、某些基因的表达，如实施例部分所述。具体实施方式 0025 下面将参考附图详细描述示例性实施方式，以便本领域的普通技术人员可以理解。本发明的理念可以以各种形式来体现，而不限于本发明所阐述的示例性实施方式。 0026 本发明提供了用于微生物发酵包括CO2的气体底物的方法，所述方法包括： 0027 向微生物提供一气体底物和一液体培养基，其中所述液体培养基包括乳酸和/或它们的盐，并且其中所述气体底物包括CO2，和 0028 使微生物产生选自酸和醇的至少一种产物。 0029 本发明还提供了一种提高微生物发酵中碳捕获效率的方法，包括： 0030 向微生物提供一气体底物和一液体培养。

22、基，其中所述液体培养基包括乳酸和/或它们的盐，并且其中所述气体底物包括选自CO和CO2的至少一种碳源，和说明书 2/9 页 5 CN 103911401 B 5 0031 使微生物产生选自酸和醇的至少一种产物。 0032 在一些实施方式中，所述微生物选自可通过Wood-Ljungdahl （WL）通路将CO2和/或 CO转化为选自酸和醇的至少一种产物的任何厌氧有机体。 0033 在一些实施方式中，所述微生物选自化能自养微生物。 0034 在一些实施方式中，所述微生物选自光合微生物，其经基因工程改造以便能够通过Wood-Ljungdahl （WL）通路将CO2和/或CO转。

23、化为选自酸和醇的至少一种产物。 0035 在一些实施方式中，所述微生物选自醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）、食氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）、难辨梭菌（Clostridium difficile）、杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、热乙酸穆尔氏菌（原热乙酸梭菌， Moorella thermoacetica， Clostridium thermoaceticum）、嗜热自养甲烷杆菌（Methanobact。

24、erium thermoautotrophicum）、自养脱硫杆菌（Desulfobacterium autotrophicum）、斯蒂克兰德氏梭菌（Clostridium sticklandii）、嗜热自养梭菌（Clostridium thermoautotrophicum）、蚁酸醋酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、大梭菌（Clostridium magnum）、甲醇醋酸杆菌（Acetobacterium carbinolicum）、凯伍醋酸杆菌（Acetobacterium kivui）和伍氏醋酸杆菌（Ace。

25、tobacterium woodii）。 0036 术语 “包括CO2的气体底物” 和类似术语应理解为包括其中二氧化碳（CO2）可用于微生物生长和/或发酵的任何气体底物。类似地，术语 “包括选自CO和CO2的至少一种碳源的气体底物” 应理解为包括其中CO和/或CO2可用于微生物生长和/或发酵的任何气体底物。 0037 在一些实施方式中，气体底物可以是作为工业过程的副产物或从例如汽车排放废气等其他来源所获得的包括CO2和/或CO的废气。示例性工业过程包括但不限于：石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。根据包括CO2和/或CO 。

26、的气体底物组合物，在将其引入发酵之前，可能需要从气体底物中去除不需要的杂质，如尘埃颗粒。例如，可使用已知的方法过滤或清洗气体底物。 0038 在一些实施方式中，所述气体底物可进一步包括选自氢气（H2）和氮气（N2）的至少一种气体。 0039 在一些实施方式中，所述气体底物是包括CO2、 CO和H2的合成气体（ “合成气” ）。合成气可通过天然气的蒸汽重整或者由各种有机材料例如生物质、有机废弃物、煤、石油、塑料或其它含碳材料的气化而产生。 0040 在一些实施方式中，所述气体底物可包括至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50。

27、%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%体积的CO2。在一些实施方式中，所述气体底物可包括20%至80%的CO2。作为非限制性的例子，所述气体底物可包括20%的CO2和80%的H2。 0041 通常， CO2和/或CO将以气态形式提供给微生物。然而，在一些实施方式中，可以提供液态形式的CO2和/或CO。例如，将一液体用包含CO2的气体底物进行饱和，然后将该液体添加到生物反应器中。 0042 在一些实施方式中，可向微生物提供还原性化学物质和/或电极作为用于CO2固定的电子源。 0043 在一些实施方式中，可向微生物提供至少一种电子源用于CO2固。

28、定，其中所述至少一种电子源可选自氢（H2）、还原性碳化合物（非限制性例子： CO、甲酸和甲醇）、硫化合物（非说明书 3/9 页 6 CN 103911401 B 6 限制性例子： H2S和S）和氮化合物（非限制性例子： NH3）。 0044 在一些实施方式中，为了提高碳捕获和/或CO2固定的效率，向微生物提供包含乳酸和/或其盐的液体培养基。 0045 在一些实施方式中，向微生物提供的液体培养基可包括0.5g/L至3g/L乳酸和/或其盐。作为非限制性的例子，向微生物提供的液体培养基可包括，例如0.5g/L、 1g/L、 1.25g/ L、 1.5g/L。

29、、 1.75g/L、 2g/L、 2.25g/L、 2.5g/L、 2.75g/L或3g/L乳酸和/或其盐。 0046 在一些实施方式中，向微生物提供的液体培养基可包括足够量的乳酸和/或其盐以诱导与Wood-Ljungdahl （WL）通路中涉及的基因的表达。 0047 例如，在某些实施方式中，乳酸和/或其盐存在的量可足以诱导至少一种基因的表达，所述基因选自et al .,Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas （2010）中所述的Wood-Ljungd。

30、ahl通路中涉及的CLJU_c37670、 CLJU_c37570、 CLJU_c37550、 CLJU_c37580、 CLJU_c06990、 CLJU_ c20040、 CLJU_c08930、 CLJU_c07020、 CLJU_c37650、 CLJU_c37640、 CLJU_c37630、 CLJU_ c37610、 CLJU_c37560和CLJU_c09110。 0048 在某些实施方式中，相对于在相同条件但不存在乳酸和/或其盐的情况下培养的微生物而言，乳酸和/或其盐存在的量可足以诱导Wood-Ljungdahl通路中涉及的至少一种基因增加表达约1.5倍或以上。 0。

31、049 在某些实施方式中，相对于在相同条件但不存在乳酸和/或其盐的情况下培养的微生物而言，乳酸和/或其盐存在的量可足以诱导Wood-Ljungdahl通路中涉及的至少一种基因增加表达约1.5倍或以上。作为非限制性的例子，相对于在相同条件但不存在乳酸和/ 或其盐的情况下培养的微生物而言，乳酸和/或其盐存在的量可足以诱导Wood-Ljungdahl 通路中涉及的至少一种基因增加表达约1.5倍至约10倍。 0050 在一些实施方式中，相对于在相同条件但不存在乳酸和/或其盐的情况下培养的微生物而言，液体培养基中存在的乳酸和/或其盐的量可足以诱导选自codH、 codH 、 codH。

32、、 codH、 coos1和metF的至少一种基因增加表达约1.5倍至约10倍。作为非限制性的例子，相对于在相同条件但不存在乳酸和/或其盐的情况下培养的微生物而言，液体培养基中存在的乳酸和/或其盐的量可足以诱导选自codH、 codH 、 codH 、 codH、 coos1和metF的至少一种基因增加表达约1.5倍至约8倍。 0051 为了促进微生物生长和/或CO2和/或CO固定，除了所述乳酸和/或其盐外，还可以向液体培养基增补适于细菌生长的额外的营养物或成分。例如，用于培养微生物的培养基还可包括足以使微生物生长的维生素、盐、提取物和/或矿物质。 0052 在一。

33、些实施方式中，用于CO2和/或CO的固定方法是在发生所期望的发酵（如从CO2 到酸）的条件下进行。可以考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基的氧化还原电位、搅拌速率（如果使用连续搅拌釜式反应器）、接种水平、最大气体底物浓度，以确保在液相中的CO2或其它组分不受限制，并且使产物浓度最大化以避免产物抑制。 0053 在一些实施方式中，所述方法可以在任何适合的生物反应器中进行，底物可以在其中与一种或多种微生物接触，例如，连续搅拌釜式反应器、固定化细胞反应器、气升式反应器、鼓泡塔反应器、膜反应器例如中空纤维膜生物反应。

34、器、或喷淋床反应器、整体式生物说明书 4/9 页 7 CN 103911401 B 7 反应器或环式反应器。 0054 在一些实施方式中，本发明所述发酵工艺可生产的产物包括但不限于醇和/或酸。示例性的酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙烯酸、脂肪酸；以及示例性的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、丁醇和2,3-丁二醇。 0055 在发酵产物中，本发明使用的术语 “酸” 包括羧酸和相关的羧酸根阴离子。例如，术语 “醋酸” 包括单独的游离醋酸、醋酸盐以及游离醋酸和醋酸盐的混合物。 0056 术语 “脂肪酸” 包括带有长脂肪链的羧酸。在一些实施方式中。

35、，脂肪链可以是线形的或分支的，以及饱和的和不饱和的。在一些实施方式中，脂肪链可包含例如4至12个碳原子， 5至11个碳原子，或者8至10个碳原子。 0057 发酵方法中的选自酸和醇的至少一种产物可用任何已知方法回收。 0058 作为非限制性的例子，可以通过如分馏或蒸发以及提取发酵的方法从发酵液回收乙醇。 0059 作为非限制性的例子，可以使用包含活性炭过滤器的吸附系统从发酵液中回收醋酸盐。在这种情况下，可以首先使用合适的分离单元从发酵液中除去微生物。然后将无细胞、含醋酸盐的培养基通过含有活性碳的柱子以吸附醋酸盐。醋酸盐以酸的形式（醋酸）而不是盐（醋酸盐。

36、）的形式更容易被活性炭吸附。因此，通过活性碳柱之前，可将含醋酸盐且无细胞的培养基的pH值降低到小于约3，以使大部分的醋酸盐转化为醋酸的形式。 0060 进一步地，作为非限制性的例子，发酵液中存在的丁酸可通过使用脂肪族胺萃取来回收和纯化，如Alamine 336 （三辛/癸基胺； Alamine336Cognis,Cincinnati， OH， USA），或其他非水溶性溶剂。 0061 从说明书以及本发明所披露的实践来考虑，本发明的其他实施方式对本领域的技术人员而言是显而易见的。说明书和实施例仅作为示范性例子，本发明真正的范围和精神由后面的权利要求书限定。 00。

37、62 实施例 0063 【实施例1】 0064 微生物 0065 Clostridium ljungdahlii BCRC 17797 （DSM No.13528;BCRC No.17797）购自台湾生物资源保存及研究中心（Taiwan）。已知该菌株是利用大气中的如CO； CO2和H2的混合气；或合成气体（CO和H2）等碳源通过Wood-Ljungdahl通路（图1）生长和产生代谢物。见 et al， Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas,Pro。

38、c Natl Acad Sci USA,107(29),pp.13087-13092(2010)。 0066 材料 0067 改良的PETC基础培养基，包含（每升）：蛋白酶蛋白胨（10g），酵母提取物（3g）和刃天青原液（0.5mL， 0.1%， w/v）。见Cottera JL et al,Influence of process parameters on growth of Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum on synthesis gas,Enzyme and Microbial T。

39、echnology 44(5),pp.281-299(2008)。 0068 ATCC1754盐溶液，包含（每升）： NH4Cl （20g）， KCl （2g）， MgSO47H2O （4g）， NaCl （16g）， KH2PO4（2g）和CaCl2（0.4g）。说明书 5/9 页 8 CN 103911401 B 8 0069 维生素溶液，包含（每升）：生物素（2mg），叶酸（2mg），吡哆醇（10mg），盐酸硫胺素（5mg），核黄素（5mg），烟酸（5mg），钙D （+）泛酸（5mg），维生素B12 （5mg），。

40、p-氨基水杨酸（5mg）和硫辛酸（thioctic）（5mg）。 0070 微量元素溶液包含（每升）：氨三乙酸（2g）， MnCl24H2O （1.3g）， FeSO47H2O （0.4g）， CoCl26H2O （0.2g）， ZnSO47H2O （0.2g）， CuCl22H2O （0.02g）， NiCl26H2O （0.02g）， Na2MoO42H2O （0.02g）， Na2SeO3（0.02g）和Na2WO42H2O （0.025g）。 0071 改良的PETC培养基（mPETC）， pH6.8：向1升改良的PETC基础培养基中补以50。

41、ml ATCC1754盐溶液， 10ml的维生素溶液和10ml的微量元素溶液以制备mPETC。然后将所制备的培养基分装到血清瓶中，然后在121、 15psi下高压灭菌1520分钟。 0072 用于厌氧培养的气密瓶：将200ml钳口血清瓶用橡胶塞密封，橡胶塞进一步用铝钳口固定就位以确保气密封闭。 0073 方法 0074 Clostridium ljungdahlii首先用含有10g/L果糖的mPETC培养基于37下在上述一个气密瓶中厌氧培养。当OD600值达到1至1.5的范围时，将培养基于3500rpm下离心210秒。将所得细胞沉淀物重悬于无果糖的mPETC，然后进一步在。

42、37下厌氧培养1小时以除去任何残余的糖底物。 0075 将45ml mPETC培养基加入上述钳口血清瓶中，然后用铝箔覆盖并于121、 15psi 下高压灭菌15分钟。冷却后，将所述含培养基的瓶子转移到厌氧室内，并向培养基添加50 l 的半胱氨酸-HCl （50%w/v）以去除任何溶解氧。 0076 对于实验组，进一步向培养基中加入乳酸钠溶液以获得2.5g/L （约0.022M）的乳酸浓度。 0077 对于钠离子对照组，向培养基中加入NaCl溶液以获得1.52g/L （约0.026M）的NaCl 浓度。该对照组是设计来测试乳酸钠中钠离子的存在是否在二氧化碳固定中发挥作用。。

43、因此，该实验组中加入相同摩尔量的钠离子。 0078 对于无添加剂对照组，向培养基中加入适量的水。 0079 然后向每个含有45ml mPETC培养基的血清瓶接种5ml已去除残糖的Clostridium ljungdahlii培养物。在这个点上的采样标记为T=0样品。然后将瓶子用橡胶塞密封并进一步覆盖铝质钳口盖以确保气密封闭。 0080 先用注射针头把含有80%N2和20%CO2的气体混合物以10psi压力吹扫气密瓶内顶部的空间。同时用另一支注射针头插入到橡胶塞使瓶子里的气体排出。吹扫混合气体约30秒后，瓶子内获得充填二氧化碳的厌氧条件。 0081 然后，经由注射针头向。

44、瓶子内顶部的空间进一步以20psi压力吹扫另一种含80%H2 和20%CO2的气体混合物以代替先前的气体混合物。约30秒后，去除针头，瓶子内部的压力积聚到约20psi。然后将瓶子移到37的孵化器并放置在提供振荡速度为100rpm的摇床上。 0082 每12小时，用针头来释放瓶子内积聚的气体，并按上述相同方法向瓶子内的顶部空间进行吹扫和更新，以在稳定的压力条件下补充气态碳源。 0083 用带有针头的注射器来收集液体样品。测定OD600之后，将液体样品于12,000rpm下离心10分钟。将得到的细胞沉淀物储存在700 l TRIzol溶液中用于后续的RNA提取和基因表达。

45、分析。将上清液用Agilent 1100系列高效液相色谱仪（HPLC）与Aminex HPX-87H （300mm 说明书 6/9 页 9 CN 103911401 B 9 x7.8mm）管柱进行分析。 0084 结果 0085 图2显示了各组培养基中细菌生长指标OD600的变化，（a）实验组（包含2.5g/L乳酸钠），（b）钠离子对照组（包含1.52g/L的NaCl），（c）是无添加剂对照组。在所有的组别中，前 70个小时内Clostridium ljungdahlii BCRC 17797都快速生长，然后它们的生长率缓慢下来。 0086 在t=144小时，。

46、OD600值为：（a）含有乳酸钠的实验组达0.71，（b）钠离子对照组达 0.82，（c）无添加剂对照组达0.79。因此，观察到的这三组的增长率并无显著差异。 0087 用HPLC分析t=144小时的培养基样品，如表1所示，当提供CO2作为碳源时，在mPETC 中生长的Clostridium ljungdahlii BCRC17797能够产生醋酸。 0088 如表1所示，于t=144小时，实验组中的醋酸浓度高于无添加剂对照组或钠离子对照组。且无添加剂对照组于t=144小时的醋酸浓度与钠离子对照组的醋酸浓度几乎相同。 0089 表1 0090 0091 表1的数据进一步显。

47、示了实验组的乳酸浓度从2.92g/L （t=0）下降至2.25g/L （t= 144）。这表明细菌消耗了少量的乳酸（即0.67g/L）。消耗的0.67g/L的乳酸可提供约0.022M 的碳原子，且实验组产生的6.39g/L醋酸包含约0.213M的碳原子。这表明至少0.191M （0.213 减去0.022M）的碳原子来自气体混合物中存在的CO2。 0092 如上表1所示，培养144小时后，无添加剂对照组产生约4.97g/L的醋酸，其含有约 0.166M的碳原子，钠离子对照组产生约4.91g/L的醋酸，其含有约0.164M的碳原子。因此，被实验组转化（固定）。

48、为醋酸的CO2量（0.191M （即实验组产生的醋酸中存在的碳原子减去可能从乳酸转化而成的碳原子量））比无添加剂对照组（无添加剂对照组中产生的醋酸中存在 0.166M碳原子）或钠离子对照组（钠离子对照组中产生的醋酸中存在0.164M碳原子）至少高出约15%。这显示了实验组培养基中存在的乳酸增强了Clostridium ljungdahlii BCRC 17797的二氧化碳固定。 0093 使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）量化表2中列出的特定基因的表达。 0094 表2 0095 基因蛋白质表达代码乳酸通透酶乳酸通透酶（将乳酸运输入细胞的酶）CLJU_c21。

49、610 说明书 7/9 页 10 CN 103911401 B 10 codHcodH/CO脱氢酶CLJU_c37670 codH CO脱氢酶/乙酰CoA合成酶亚基CLJU_c37550 codH CO脱氢酶/乙酰CoA合成酶亚基CLJU_c37580 codHCO脱氢酶/乙酰CoA合成酶亚基CLJU_c37570 cooS1厌氧型一氧化碳脱氢酶CLJU_c09110 metF亚甲基四氢叶酸还原酶CLJU_c37610 0096 注： CO脱氢酶是细菌通过WL通路转化CO2气体使用的酶之一；它也是用于合成乙酰辅酶A的一种酶。 0097 如图3所示，相对于无添加剂对照组，实验组的培养基中存在的乳酸诱导：（i）乳酸通透酶增加约11倍，表明该细菌对乳酸有反应；（ii） codH、 codH 、 codH 和codH增加约4至 8倍；（iii） cooS1增加约3倍；和（iv） metF增加约4倍。 0098 如图4所示，相对于钠离子对照组，实验组的培养基中存在的乳酸诱导乳酸通透酶、 codH、 codH。