拮抗木霉菌系统诱导玉米抗病性MAMP/DAMP模式的研究
【摘要】：本研究以生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Th30为出发菌,研究木霉菌系统诱导玉米抗弯孢菌叶斑病(Curvularia lunata)微生物相关分子模式/损伤相关分子模式(MAMP/DAMP)。本试验共构建450株ATMT突变株,经过筛选后,共获得6株对诱导玉米抗叶斑病差异明显的突变株。Southern blot分析表明T-DNA为单拷贝插入。通过反向PCR扩增到侧翼序列,分析表明,突变株与野生株的功能差异是因为T-DNA插入到基因的ORF框,该基因命名为Thc6,编码327个氨基酸,为C6型锌指转录因子。为了研究该基因的功能,构建了该基因的敲除子、互补子及过表达子。研究表明,该基因对菌体生长无明显影响;通过荧光标记发现该基因定位于细胞核中;挑战接种表明,通过表达该基因后,玉米对弯孢菌叶斑病抗性高于野生株。RT-qPCR结合LC-MS测定水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(iasmonic acid,JA)含量表明,发现该基因通过影响玉米的茉莉酸(iasmonic acid)代谢通路调控玉米的抗病能力。以上结果表明,Thc6通过调控玉米茉莉酸代谢相关通路,从而调控玉米对弯孢霉叶斑病的抗性。通过酵母单杂交技术从哈茨木霉基因组中筛选到两段与Thc6蛋白互作的DNA片段,扩增侧翼序列,并结合生物信息学分析,获得被Thc6调控的两个纤维素水解酶基因Thph1、Thph2。EMSA实验确定蛋白与基因启动子区的结合区域为6个碱基的保守区域。在纤维素为唯一C源诱导下,基因Thph1、Thph2表达水平受纤维素底物调控,而敲除Thc6基因后,调控不明显。分别敲除Thoh1、Thph2或同时敲除两个基因后,突变株在纤维素为唯一C源培养基上生长明显减慢。透射电镜观察表明,木霉菌主要定殖于玉米根表皮层细胞内。Western blot检测到在木霉菌定殖的玉米根部皮层内有Thph1、Thph2蛋白的分泌;分别用蛋白Thph1、Thph2处理玉米根系后,能够系统诱导玉米对弯孢菌叶斑病的和茎腐病防御反应;HPLC分析发现木霉菌定殖的玉米根皮层组织有木霉菌纤维素酶降解的纤维素释放的纤维二糖;RT-qPCR测定表明玉米防御相关基因Opr7、Erf1表达上调,防御过程中,蛋白处理后的玉米活性氧暴发强度也高于野生株。定量蛋白质组学分析发现,Thph1基因敲除子处理种子长出的玉米根系,可导致玉米根系、叶片防御反应JA/ET通路相关蛋白MYC2、ACO表达下调,活性氧清除相关蛋白POD表达也明显下调,茎腐病菌侵染发生变化,进一步说明木霉菌纤维素酶及纤维二糖作为激发子可诱导寄主防御反应信号长距离转导,从而引发玉米根系对茎腐病菌、叶片对弯孢菌叶斑病菌的防御反应。
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