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玫瑰海棠试管花的培养方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-12 19:55

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1、(10)授权公告号 CN 102217549 B (45)授权公告日 2012.07.25 CN 102217549 B *CN102217549B* (21)申请号 201110147710.3 (22)申请日 2011.06.03 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人张曦予地址 650091 云南省昆明市五华区翠湖北路 2号云南大学东一院10幢1单元101号专利权人李宗菊 (72)发明人不公告发明人 CN 101292630 A,2008.10.29, 司亮等 . 丽格海棠的组织培养与快速繁殖 .哈尔滨师范大学自然科学学报 .2009, 第。

2、 25 卷 ( 第 4 期 ), 王发林等 . 丽格海棠的叶片离体培养技术 .甘肃农业科技 .2001,( 第 5 期 ), 胡燕梅等 . 丽格海棠叶片离体培养技术研究 . 武汉生物工程学院学报 .2008, 第 4 卷 ( 第 4 期 ), (54) 发明名称玫瑰海棠试管花的培养方法 (57) 摘要本发明涉及一种玫瑰海棠试管花的培养方法，属于植物组织培养及试管开花技术领域。其特征是，以玫瑰海棠的成熟叶片作主要外植体，通过外植体消毒处理、丛生芽诱导、小苗生长与增殖、试管内成花培养等途径，成功地增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的试管花。

3、。本发明操作简单，实验周期短，生产成本低，所生产的试管花，与传统栽培模式相比，花期可随意调控，不受季节影响，且节约了能源及场地，它对于美化生活和工作环境，调节花期淡季，增加观赏花的新品种、新形式，探索开花机理等将具有重要实践意义。玫瑰海棠因其在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发精品试管花，提高其观赏特性，创造更高的经济价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员艾欣权利要求书 1 页说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种。

4、玫瑰海棠试管花培养的方法，其特征在于采用玫瑰海棠叶片形成丛生芽的快速繁殖方法，在此基础上对其试管苗进行花芽诱导，它包括下列步骤：（1）材料的选择：选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；（2）外植体灭菌处理：先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 50-80s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用无菌水反复漂洗6-8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；（3）丛芽的诱导：将消毒后的叶片切成约 1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基。

5、表面，培养基为MS培养基，补充6-苄基氨基嘌呤6-BA0.51.0mg/L，吲哚乙酸IAA1.52.0mg/ L， PH 值为 5.8 6.0， 10 12 天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织， 19 22 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至 33 36 天开始长出许多丛芽，培养条件为温度 20-23，光照强度 1500-2500Lux，光照时间 5 8h/ 天；（4）增殖培养：将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS培养基，补充6-BA1.01.5mg/L，吲哚丁酸IBA0.20.5mg/L， PH值为5.86.0，。

6、 23 26 天，已长成 3-4cm 的小苗，并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为 9-12 倍，培养条件为温度 20-23，光照强度 2000-2500Lux，光照时间 10 12h/ 天；（5）试管内成花培养：待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5 片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA0.01 0.03mg/L， IAA0.1 0.2mg/L，多效唑 MET0.1 0.3mg/L， PH 值为 5.8 6.0，培养 2 周时更换一次新鲜培养基，。

7、 24 27 天，顶芽分化出花蕾， 33 36 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 1-3 朵，花朵外观、色泽正常，成花率为 70 75%，培养条件为温度 20-23，光照强度 2000-2500Lux，光照时间 10 12h/ 天。 2. 根据权利要求 1 的玫瑰海棠试管花培养方法，其特征步骤（1）也可选用玫瑰海棠幼嫩的顶芽或侧芽；特征步骤（3）为：将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0 1.5mg/L， IBA0.1 0.3mg/L， PH 值为 5.8 6.0， 10 12 天芽开始生长，。

8、约 1 个月形成 3-4cm 的丛生小苗，培养条件为温度 20-23，光照强度 2000-2500Lux，光照时间 11 12h/ 天；特征步骤（4）为：将从芽外植体得到的小苗进行继代增殖，增殖培养基同上，培养条件同上。权利要求书 CN 102217549 B 2 1/5 页 3 玫瑰海棠试管花的培养方法技术领域 0001 本发明涉及一种观赏花卉玫瑰海棠试管花的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于植物组织培养及试管成花技术范畴。背景技术 0002 玫瑰海棠（Begonia mannii），别名丽格海棠，为秋海棠属的一种多年生常绿草本花。

9、卉，是近年从国外引进的新品种，为上世纪 50 年代荷兰育种家 Peigen 利用球根秋海棠（Begonia tuberhybrida）与索科特拉海棠（Begonia socotrana）杂交育成的新品系。其株形极像球茎秋海棠，但无明显的球茎；其花色娇艳，花大色丽，具有玫瑰般的姿、色、香，因而被称为玫瑰海棠。其具有以下几大特点：花色娇嫩柔美、艳丽多彩（有紫红、大红、粉红、黄、橙黄、白复色等）；花朵繁密、花型多样（花瓣有单瓣、半重瓣、重瓣以及花瓣皱边等多种）、花姿优美；其枝叶强壮，叶形美丽（心形），叶色多样（绿色、。

10、棕色等）；花期长达 4-6 个月；较耐荫，抗逆性强，适于室内观赏栽培，盆栽可用来点缀会议室、客厅、会客室、卧室、书房、阳台、橱窗等，小巧玲珑，雅致美观，窈窕妩媚，风姿卓越，也可装入艺术吊篮悬挂于室内观赏，艳丽华贵，别具一格。因此，其高价值的观赏性，使其经济价值提高 , 目前已成为世界著名的球根盆栽花卉之一。 0003 玫瑰海棠的研究主要集中于栽培、育种及组织培养方面。玫瑰海棠播种繁殖所需时间长，主要采用扦插或分株繁殖，但茎段扦插成活率低，分株繁殖速度慢 , 且易产生变异、品种退化，难以满足市场大量需求。而组织培养技术具有繁殖速。

11、度快，增殖倍数高，周期短，品种复状等特点 , 玫瑰海棠为草本花卉，且组织的再生能力很强，利用组培技术可以在短期内培育大量小植株，为生产上提供大量种苗，加快繁殖速度，提高经济效益。因此近年来，玫瑰海棠的组培快繁技术研究在国内外报道较多。这为玫瑰海棠种苗的规模化快速繁殖提供了一条可靠而有效的途径，克服了传统繁殖方法的不足。 0004 玫瑰海棠自引入我国后，很受欢迎，市场销量很好。但按照传统的栽培模式，玫瑰海棠的开花时间及花期仍然不够理想。玫瑰海棠性喜冷凉，生长适温在 15 -28，适合秋季扦插，春天即可开花。但春季的气温已渐升高，花不耐久放，市场接。

12、受度不大。若改为5-6 月份扦插，则花期刚好在冬末春初的元旦、春节开放，且花期大大延长。但 5-6 月，我国大部分地区气温已升高，怎样在自然条件下度过炎热夏季是栽培上的重点和难点。建空调温室要花费大量的财力或能源，也不理想。因此，如在传统的秋季栽培模式下，能利用简单的技术，对花期进行调控，使其提前开花，这无疑是一种很好的途径。而试管花的研究，刚好可以解决这一问题。试管成花 , 即在培养瓶内直接诱导开花，对于研究传统栽培模式下植物的开花机制、花期调控、试管育种等具有重要的指导意义，还可节约通过改变栽培环境如增建温室等来延长花期所耗费的能源。这是目前。

13、植物成花研究的一个新的领域及热点。 0005 试管成花，具有大田栽培无可比似的优点，如成花时间、花期可随意调控，不受季节影响，且实验周期短，而成熟的技术又可以直接用于大田生产。另外，如能培育出观赏价值很高的试管花，并能在室内进行大规模化的生产，它对于美化生活和工作环境、调节花期说明书 CN 102217549 B 3 2/5 页 4 淡季、增加观赏花的新品种、新形式等将具有重要实践意义。 0006 试管花的研究在国外几年前就有报道，在我国近年才起步。但主要集中于兰花，如法国的 Julien Costantin 于 1999 年进行了兰科植物的试管开花研。

14、究，郑立明等于 2005 年对中国兰的试管开花进行了研究。 0007 玫瑰海棠试管内开花目前在国内外报道极少。玫瑰海棠在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发试管花。本发明旨在培育小型、精巧且具有高观赏价值的离体试管花，提高玫瑰海棠的观赏特性，创造更高的经济价值。为今后进行玫瑰海棠试管花的规模化生产提供技术依据，为其它高档花卉的观赏性精品试管花的生产提供借鉴，也为玫瑰海棠大田栽培条件下的花期调控提供理论依据。发明内容 0008 本发明的目的在于，提供一种操作简单，周期短，生产成本低，具有高观赏价值的玫瑰海棠离体试管花的生产方法。 000。

15、9 本发明的技术方案，其步骤为： 0010 1材料的选择：选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片或芽（顶芽或侧芽）。 0011 2外植体灭菌处理：先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 50-80s，然后置于 0.1% 升汞溶液中消毒 8-15min，最后用无菌水反复漂洗 6-8 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分； 0012 3丛芽的诱导： 0013 （1）叶片外植体将消毒后的叶片切成约 1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，。

16、补充6-苄基氨基嘌呤（6-BA） 0.51.0mg/L，吲哚乙酸（IAA） 1.5 2.0mg/L， PH 值为 5.8 6.0， 10 12 天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织， 19 22 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至3336天开始长出许多丛芽，培养条件为温度 20-23，光照强度 1500-2500Lux，光照时间 5 8h/ 天。 0014 （2）芽外植体将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0 1.5mg/L， IBA0.1 0.3mg/L， PH 值为 5.8 6.0， 10 12 天芽开始。

17、生长，约 1 个月形成 3-4cm 的丛生小苗。 0015 4增殖培养：将从外植体得到的丛芽或小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0 1.5mg/L，吲哚丁酸（IBA） 0.2 0.5mg/L， PH 值为 5.8 6.0， 23 26 天，已长成 3-4cm 的小苗 , 并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9-12倍，培养条件为温度20-23，光照强度2000-2500Lux，光照时间 10 12h/ 天。 0016 5试管内成花培养：待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5。

18、片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.01 0.03mg/L， IAA0.10.2mg/L，多效唑（MET） 0.10.3mg/L， PH值为5.86.0，培养2周时更换一次新鲜培养基， 24 27 天，顶芽分化出花蕾， 33 36 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 1-3 朵，花朵外观、色泽正常，成花率为 65 75%，培养条件为温度 20-23，光照强度 2000-2500Lux，光照时间 10 12h/ 天。说明书 CN 102217549 B 4 3/5 页 5 0017 本发。

19、明的有益效果是：直接利用玫瑰海棠叶片，增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的玫瑰海棠试管花，其特点如下： 0018 （1）操作简单。利用几种成分简单的培养基，即可将叶子培养成丰富多彩的小花。本发明也试验了利用芽直接诱导丛生小芽的途径（芽芽），但是在生产上，如果大量取芽，会导致田间植株生长不良，或者要牺牲整个植株。取叶相对比较理想，不会太多影响植株。而且本发明利用叶片，采用附加 6-BA 及 IAA 的简单 MS 培养基，不需产生愈伤组织，直接从叶表面诱导出了小芽，这是非常理想的。因为如果先通过产生愈伤组织，再从组织块上分生。

20、小芽，通过了器官细胞器官的过程，在这个过程中可能会发生变异，难免保证原品种的优良特性。而且通过这条途径，愈伤组织往往需要经过继代培养，历时较长，不是最佳快速繁殖途径。这点也是本发明的创新点之一，目前尚未有资料报道通过这种叶芽（器官器官）的途径来获得新生芽的。 0019 （2）周期短。本发明从采摘田间叶片外植体，到获得无菌的丛生芽，通过增殖的健状无根小苗，直接诱导小型开花植株，整个过程大约需要 100 天左右，与田间的自然生长过程（从扦插小苗大植株开花，约需 16-18 个月）相比，明显缩短了生长周期。如果不经过外植体的诱导阶段，有现成的。

21、无菌小苗，只需 1 个月左右的时间即可生产出瓶花。而且本发明选用的增殖培养基配方，增殖倍数能达到 9-12 倍，也能明显地提高生产效率。 0020 （3）生产成本低。本发明的培养基配方中，只利用了四种简单的生长激素（6-BA、 IAA、 IBA、 MET），就可以完成整个生产过程。而且这几种激素成本比较低，是组培中常规使用的试剂。这一点非常重要，否则关系到以后的生产规模及推广使用等问题。 0021 本发明所用的成花培养基，激素组合比较简单，而且首次在玫瑰海棠中创新地使用了 MET（多效唑），而且成花效果还比较好。外植体是否能分化出花芽与植物的发育、营养及。

22、激素的种类和用量有着密切的关系，激素的种类和用量又起着决定性的作用。多效唑（Paclobutrazol，又名 Multiple-Effect Triazole,MET）是 20 世纪 80 年代初发现的新型植物生长调节剂，对于提高植物抗逆性、促进成花和坐果、壮苗生根等具有重要作用，现已广泛应用于大田生产。多效唑在玫瑰海棠开花调节中的作用机理，还值得探讨。具体实施方式 0022 以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 0023 实例一： 0024 从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来。

23、水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 50s，然后置于 0.1% 升汞溶液中消毒 8min，最后用无菌水反复漂洗 6 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。 0025 将消毒后的叶片切成约 1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为 MS 培养基，补充6-BA0.5mg/L， IAA1.5mg/L， PH值为5.8， 10天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织， 19 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至 35 天开始长出许多丛芽，培养条件为温度 22，光照强度 2000Lux，光照时间 6h/ 天。。

24、0026 将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0mg/L， IBA0.3mg/L， PH 值为 6.0， 23 天 , 已长成 3-4cm 的小苗 , 并从苗基部说明书 CN 102217549 B 5 4/5 页 6 又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为 9 倍，培养条件为温度 23，光照强度 2500Lux，光照时间 12h/ 天； 0027 待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5 片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为 MS 培养基。

25、，补充 6-BA0.01mg/L， IAA0.2mg/L， MET0.1mg/L， PH 值为 5.8，培养 2 周时更换一次新鲜培养基， 25 天，顶芽分化出花蕾， 35 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 2 朵，花朵外观、色泽正常，成花率为 75%，培养条件为温度 23，光照强度 2000Lux，光照时间 11h/ 天。 0028 实例二： 0029 从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 80s，然后置。

26、于 0.1% 升汞溶液中消毒 15min，最后用无菌水反复漂洗 8 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。 0030 将消毒后的叶片切成约 1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为 MS 培养基，补充6-BA1.0mg/L， IAA2.0mg/L， PH值为6.0， 12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织， 20 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至 33 天开始长出许多丛芽，培养条件为温度 21，光照强度 1500Lux，光照时间 8h/ 天。 0031 将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6。

27、-BA1.5mg/L， IBA0.5mg/L， PH 值为 5.8， 26 天 , 已长成 3-4cm 的小苗 , 并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为 12 倍，培养条件为温度 22，光照强度 2000Lux，光照时间 10h/ 天； 0032 待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5 片小叶时 ,，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA0.03mg/L， IAA0.2mg/L， MET0.3mg/L， PH 值为 5.8，培养 2 周时更换一次新鲜培养基， 27 天，顶。

28、芽分化出花蕾， 36 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 3 朵，花朵外观、色泽正常，成花率为 70%，培养条件为温度 22，光照强度 2500Lux，光照时间 12h/ 天。 0033 实例三： 0034 从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 60s，然后置于 0.1% 升汞溶液中消毒 10min，最后用无菌水反复漂洗 7 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。 0035 将消毒后的叶片切成约 1-2cm2的小方。

29、块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为 MS 培养基，补充6-BA0.8mg/L， IAA1.8mg/L， PH值为5.9， 11天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织， 22 天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至 36 天开始长出许多丛芽，培养条件为温度 21，光照强度 2500Lux，光照时间 5h/ 天。 0036 将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.3mg/L， IBA0.2mg/L， PH 值为 5.8， 25 天 , 已长成 3-4cm 的小苗 , 并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓。

30、绿、生长健壮，增殖倍数为 11 倍，培养条件为温度 22，光照强度 2000Lux，光照时间 10h/ 天。 0037 待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5 片小叶时 ,，轻轻取出，将其从说明书 CN 102217549 B 6 5/5 页 7 基部剪切，置于成花诱导培养基中，养基为 MS 培养基，补充 6-BA0.02mg/L， IAA0.1mg/L， MET0.2mg/L， PH 值为 5.8，培养 2 周时更换一次新鲜培养基， 24 天，顶芽分化出花蕾， 33 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 3 朵，花朵外观、色泽正常。

31、，成花率为 73%，培养条件为温度 22，光照强度 2500Lux，光照时间 12h/ 天。 0038 实例四： 0039 从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠幼嫩的芽（顶芽或侧芽）；除去叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用 75% 的酒精浸泡 70s，然后置于 0.1% 升汞溶液中消毒 9min，最后用无菌水反复漂洗 7 次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。 0040 将消毒后的顶芽或侧芽，轻轻插入诱导培养基，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0mg/L， IBA0.3mg/L， PH值。

32、为5.8， 10天芽开始生长，约1个月形成3-4cm的丛生小苗。培养条件为温度 22，光照强度 2000Lux，光照时间 12h/ 天。 0041 将从芽外植体得到的无菌小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA1.0mg/L， IBA0.3mg/L， PH 值为 5.8， 25 天 , 已长成 3-4cm 的小苗 , 并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为 10 倍，培养条件为温度 22，光照强度 2200Lux，光照时间 11h/ 天； 0042 待增殖培养基中的小苗，长至 3-4 高，带 4-5 片小叶时 ,，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为 MS 培养基，补充 6-BA0.02mg/L， IAA0.2mg/L， MET0.1mg/L， PH 值为 5.8，培养 2 周时更换一次新鲜培养基， 25 天，顶芽分化出花蕾， 35 天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花 2 朵，花朵外观、色泽正常，成花率为 71%，培养条件为温度 22，光照强度 2500Lux，光照时间 12h/ 天。说明书 CN 102217549 B 7 。