一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法。
背景技术
豌豆(Pisum sativum L.)是世界四大食用豆类作物之一，种植国家已经超过90个。温带和亚热带地区的膳食蛋白质来源主要是豌豆。尽管豌豆的种植面积很大，但总产量仍然很低，在过去几十年里一直停滞不前。一些生物和非生物胁迫严重影响着豌豆的产量；此外，豌豆是自花授粉，遗传基础狭窄，而且豌豆一些性状的遗传变异有限，因此需要利用生物技术来实现对豌豆性状的改良。
基因组编辑技术是指通过核酸内切酶在基因组中特定位置产生DNA双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复断裂的双链DNA，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。因此基因编辑技术，可以通过基因组的定点修饰调控基因的表达，作为研究基因功能的重要工具。
CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌的获得性免疫系统，负责抵御噬菌体感染、质粒接合和转化等所造成的外源遗传物质入侵。CRISPR/Cas系统可特异性地识别外源DNA，切割并沉默外源基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行作物遗传改良具有很多优点，现已成功运用于多种作物如水稻、小麦、玉米、棉花等的遗传改良。但是到目前为止，在豌豆中运用CRISPR/Cas9基因编辑技术还未有任何报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法，所述基因编辑载体和基因编辑系统适用于豌豆，且编辑效率高，为豌豆的基因功能研究以及遗传育种奠定良好的基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体以pHUC411为骨架载体，还包括豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因、增强型的TM2-pd35s-dMac启动子和豌豆内源U6启动子。
优选的，所述豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述增强型的TM2-pd35s-dMac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述豌豆内源U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：用增强型的TM2-pd35s-dMac启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因和豌豆内源U6启动子分别替换掉pHUC411上原有的ZmUBI启动子、OsCas9和OsU3启动子。
本发明还提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑系统，在上述CRISPR/Cas9基因编辑载体上连接豌豆基因靶标的引物对。
优选的，所述豌豆基因靶标包括豌豆八氢番茄红素脱氢酶基因的外显子区域，识别的PAM序列为NGG。
优选的，所述豌豆基因靶标包括PsPDS1、PsPDS2或PsPDS3。
本发明还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体或上述CRISPR/Cas9基因编辑系统在提高豌豆基因编辑效率中的应用。
本发明还提供了一种豌豆基因编辑方法，包括以下步骤：将基于豌豆基因靶标设计的引物对退火后连接上述CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化到发根农杆菌感受态细胞中，进行遗传转化，得豌豆基因编辑植株。
有益效果：本发明提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，对现有的水稻基因编辑用载体pHUC411进行改造，用增强型的TM2-pd35s-dMac(简称en35s)启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白(简称PsCas9)的编码基因和豌豆内源U6启动子(简称PsU6.3)分别替换掉pHUC411上原有的玉米Ubiquitin启动子(ZmUBI)、水稻偏好密码子优化过的Cas9蛋白(OsCas9)和水稻内源U3启动子(OsU3)，从而使得PsU6.3驱动sgRNA的表达，en35s驱动PsCas9的表达。
利用所述CRISPR/Cas9基因编辑载体构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，并对豌豆进行基因编辑，在豌豆中的基因编辑效率可高达8.32％，是传统的水稻、拟南芥上基因编辑工具的8倍，并且产生了高达7种的突变类型，从而提高了豌豆基因编辑效率，为豌豆的基因功能研究以及遗传育种奠定良好的基础。
附图说明
图1为pHUC411的质粒结构；
图2为本发明所述豌豆CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶标设计图。
具体实施方式
本发明提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体以pHUC411为骨架载体，还包括豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因、增强型的TM2-pd35s-dMac启动子和豌豆内源U6启动子。
本发明所述骨架载体的质粒结构优选如图1所示(pHUC411-gttt；来自安徽省农业科学院水稻研究所生物技术研究室魏鹏程研究员课题组)，其内包含有玉米Ubiquitin启动子(ZmUBI)、水稻偏好密码子优化过的Cas9蛋白(OsCas9)和水稻内源U3启动子(OsU3)，分别用增强型的TM2-pd35s-dMac(简称en35s)启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白(简称PsCas9)的编码基因和豌豆内源U6启动子(简称PsU6.3)对上述结构进行替换，得本发明所述豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体。
本发明所述PsCas9的5＇端优选包括酶切位点Pst I和Kozak序列，3＇端包括酶切位点Sac I，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述en35s启动子的5＇端和3＇端优选分别包括酶切位点Hind III和Pst I，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述PsU6.3启动子的5＇端和3＇端分别包含酶切位点Hind III和Pst I，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：用增强型的TM2-pd35s-dMac启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因和豌豆内源U6启动子分别替换掉pHUC411上原有的ZmUBI启动子、OsCas9和OsU3启动子。
本发明对所述替换的方法并没有特殊的限定，利用本领域的常规载体结构替换方法即可。
本发明还提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑系统，在上述CRISPR/Cas9基因编辑载体上连接豌豆基因靶标的引物对。
本发明所述豌豆基因靶标包括豌豆八氢番茄红素脱氢酶(PsPDS)基因的外显子区域，识别的PAM序列为NGG(图2)。本发明优选在PsPDS的外显子1和外显子2上选取3个靶点，分别命名为PsPDS1、PsPDS2、PsPDS3，并针对上述靶点合成靶标引物对：PsPDS1 FP、PsPDS1RP，PsPDS2 FP、PsPDS2 RP，或PsPDS3 FP、PsPDS3 RP；所述PsPDS1 FP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，所述PsPDS1 RP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示；所述PsPDS2 FP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示；所述PsPDS2RP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.7所示；所述PsPDS3 FP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示；所述PsPDS3 RP的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体或上述CRISPR/Cas9基因编辑系统在提高豌豆基因编辑效率中的应用。
利用本发明所述CRISPR/Cas9基因编辑载体或CRISPR/Cas9基因编辑系统在豌豆中的基因编辑效率可高达8.32％，最多产生7种基因突变类型，显著提高了基因编辑效率。
本发明还提供了一种豌豆基因编辑方法，包括以下步骤：将基于豌豆基因靶标设计的引物对退火后连接上述CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化到发根农杆菌感受态细胞中，进行遗传转化，得豌豆基因编辑植株。
本发明将豌豆基因靶标的引物对退火后连接上述CRISPR/Cas9基因编辑载体上，构建基因编辑系统，并将基因编辑系统转化到发根农杆菌感受态细胞中，进行遗传转化。本发明对所述构建、转化和遗传转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、克隆TM2-dp35s-dMac(en35s)得到T-en35s
1、在TM2-dp35s-dMac序列的5＇端和3＇端加入酶切位点Hind III和Pst I，形成Hind III-TM2-dp35s-dMac-Pst I(SEQ ID NO.2)，送交通用生物系统(安徽)有限公司将其合成在载体PUC57-Simple(Amp)上。
2、PCR扩增Hind III-en35s-Pst I，所用引物为：
35s-dMac Hind III FP(SEQ ID NO.10)：AAGCTTTCGATTAAAAATCCCAATTATT；
35s-dMac Pst I RP(SEQ IDNO.11)：CTGCAGATTGCGAGACAGTGCCGTGGGT。
体系(50μL)：PCR体系：
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃再延伸5min。
回收PCR扩增产物Hind III-en35s-Pst I，并将其连接到克隆载体pEASY-BluntSimple Cloning Vector上，转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
挑单克隆，划线到具有氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，同时利用SEQID NO.10和SEQ ID NO.11进行菌落PCR鉴定。
5、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行双酶切鉴定(Hind III/Pst I)。
6、将双酶切正确的质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序鉴定，测序正确的质粒即为连上T载体的T-en35s。
测序所用引物为：
M13-F(SEQ ID NO.12)：GTTGTAAAACGACGGCCAG；
M13-R(SEQ ID NO.13)：CAGGAAACAGCTATGAC；
中间引物dMac-ZF(SEQ ID NO.14)：GGCGAACCTTCGATATTTCA。
二、TM2-pd35s-dMac(en35s)启动子替换ZmUBI启动子
1、双酶切(Hind III/Pst I)T-en35s和PUC57-Simple(Amp)-SpR-t35sT，回收酶切产物。
2、连接回收产物，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有氨苄霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
3、挑单克隆，划线到具有氨苄霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上，进行菌落PCR鉴定；
菌落PCR鉴定用引物：
dMac check&Seq FP(SEQ ID NO.15)：TCCTCATTTTCTGAATCCTGGG；
SpR EcoR I RP(SEQ ID NO.16)：GAGCTCggcttattatgcac。
PCR：PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃再延伸5min
4、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行双酶切鉴定(Hind III/Pst I)。
5、将双酶切正确的质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序鉴定(测序所用引物为：M13-F和M13-R)。测序正确的质粒即为PUC57-Simple(Amp)-en35s-SpR-t35sT。
三、PsCas9替换OsCas9
1、用豌豆偏好密码子优化Cas9蛋白，并将优化后的Cas9蛋白命名为PsCas9，同时在PsCas9的5＇端加入酶切位点Pst I和Kozak序列，在3＇端加入酶切位点Sac I(Pst I-Kozak-PsCas9-Sac I，SEQ ID NO.1)再送交公司将其合成在载体PUC57-Simple(Amp)上，得到PsCas9 in PUC57-Simple。
2、双酶切(Pst I/Sac I)质粒PUC57-Simple(Amp)-en35s-SpR-t35sT和PsCas9 inPUC57-Simple，回收酶切产物。
3、连接回收产物，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
4、挑单克隆，分别划线到具有氨苄霉素/壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
5、挑取在壮观霉素抗性的LB固体培养基上不生长，在氨苄霉素抗性的LB固体培养基上生长的单克隆，进行菌落PCR鉴定。
所用引物为：
PsCas9 check 300bp to 3E FP(SEQ ID NO.17)：CAACAAGCATAGAGATAAGCCA；
PsCas9 check 300bp to 5E RP(SEQ ID NO.18)：AAAGAATCATCAACCTTAGCCA。
6、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行双酶切鉴定(Pst I/Sac I)。
7、将双酶切正确的质粒送公司测序鉴定(测序所用引物为：SEQ ID NO.15)。测序正确的质粒即为PUC57-Simple(Amp)-en35s-PsCas9-t35sT。
四、en35s-PsCas9-t35sT连接到载体PHNC-SPR载体上
1、双酶切(Hind III和EcoR I)质粒PUC57-Simple(Amp)-en35s-PsCas9-t35sT和PHNC SPR，回收酶切产物。
2、连接回收产物，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
3、挑单克隆，分别划线到具有卡那霉素/壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
4、挑取在壮观霉素抗性的LB固体培养基上不生长，在卡那霉素抗性的LB固体培养基上生长的单克隆，进行菌落PCR鉴定。
所用引物为：
PHUE Check FP(SEQ ID NO.19)：GGTGCGGGCCTCTTCGCTATTA；
35s-dMac Pst I RP(SEQ ID NO.11)。
5、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行双酶切鉴定(Hind III/EcoR I)。
6、将双酶切正确的质粒送公司测序鉴定(测序所用引物为：SEQ ID NO.15)。测序正确的质粒即为PHUC-en35s-PsCas9-t35sT。
五、PsU6.3启动子替换OsU3启动子
1、通过U6 snRNA的序列在豌豆基因组中进行blast比对，得到了5个豌豆内源U6启动子，与拟南芥U6.26启动子进行序列比对，在转录起始位点上游的启动子区存在保守的上游序列元件和TATABox。选取第3号豌豆内源U6启动子(PsU6.3)，并在PsU6.3启动子序列的5＇端和3＇端加入酶切位点Hind III和Pst I(Hind III-PsU6.3-Pst I，SEQ ID NO.3)，送交公司将其合成在载体PUC57-Simple(Amp)上，得到质粒PsU6.3 in PUC57-Simple(Amp)。
2、分别以质粒PsU6.3 in PUC57-Simple(Amp)和pHUC 411-sg2.0为模板进行PCR扩增，回收PCR产物，得到片段1和片段2；同时单酶切(EcoR I)中间载体T-SpR，回收酶切产物，得到片段3。
所用引物为：
PsU6p3 FP(SEQ ID NO.20)：TTACGCCAAGCTGCCCTTGaagcttTGTTGCTATTTTTTGTTTATCCGA；
PsU6p3 RP(SEQ ID NO.21)：ggcttatgtccactgggttggtctctGAAGTAAGGGTGA；
SpR-sg2.0 FP(SEQ ID NO.22)：ACCCTTACTTCagagaccaacccagtggacataagcctg；
SpR-sg2.0 RP(SEQ ID NO.23)：GCGAATTGAAGCTGCCCTTGaagcttAAAAAAAAgcaccgactcggt。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸5min。
将步骤2的回收产物片段1、片段2和片段3利用同源重组的方法连接到一起，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有卡那霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
4、挑单克隆，分别划线到具有卡那霉素和壮观霉素/氨苄霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
5、挑取在氨苄霉素抗性的LB固体培养基上不生长，在卡那霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上生长的单克隆，进行菌落PCR鉴定(所用引物为：SEQ ID NO.20和SEQ IDNO.23)。
6、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行单酶切鉴定(Hind III)。
7、将双酶切正确的质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序鉴定(测序所用引物为：M13-F和M13-R)。测序正确的质粒即为T-PsU6p3-SpR-sg2.0。
8、单酶切(Hind III)质粒PHUC-en35s-PsCas9-t35sT和T-PsU6p3-SpR-sg2.0，回收酶切产物。
9、连接回收产物，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有卡那霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
10、挑单克隆，划线到具有卡那霉素和壮观霉素抗性的LB固体培养基上，进行菌落PCR鉴定。
所用引物为：PHUE CheckFP和SpR EcoR I RP。
11、选取菌落PCR正确的单菌落在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，并进行单酶切鉴定(Hind II)。
12、将单酶切正确的质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序鉴定(测序所用引物为：PHUE Check FP)。测序正确的质粒即为PHUC-PsU6p3-SpR-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT。
六、靶标连接
1、靶标设计：在豌豆八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的外显子1和外显子2上选取3个靶点(图2)，识别的PAM序列为NGG。
2、合成靶标引物：
PsPDS1 FP、PsPDS1 RP、PsPDS2 FP、PsPDS2 RP、PsPDS3 FP和PsPDS3RP。
3、引物磷酸化
配制体系(50μL)：FP/RP各1μL、10×T4 DNA Ligase Buffer 5μL、T4 PNK 1μL和ddH
4、自然退火：95℃5s，关掉孵育器，自然冷却至室温，待用。
5、单酶切(Bsa I)质粒PHUC-PsU6p3-SpR-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT过夜，65℃，失活20min。
6、连接失活质粒和退火靶标，并将其转化X-Blue大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，120rpm/min，震荡培养1h。12000rpm离心30s，集菌，倒掉上清液，留100μL涂到具有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
7、挑单克隆，分别划线到具有卡那霉素/壮观霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
8、挑取在壮观霉素抗性的LB固体培养基上不生长，在卡那霉素抗性的LB固体培养基上生长的单克隆，在LB液体培养基中扩繁，提取质粒，送公司测序鉴定(测序所用引物为PHUE CheckFP)。
测序正确的质粒即为PHUC-PsU6p3-PsPDS1-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT、PHUC-PsU6p3-PsPDS2-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT和PHUC-PsU6p3-PsPDS3-sg2.0-en35sPsCas9-t35sT。
实施例2
将实施例1得到的PHUC-PsU6p3-PsPDS1-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT、PHUC-PsU6p3-PsPDS2-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT和PHUC-PsU6p3-PsPDS3-sg2.0-en35sPsCas9-t35sT分别转化到发根农杆菌感受态细胞K599中，进行遗传转化，约4w后长出毛状根，提取毛状根的DNA，PCR扩增靶标区域，并将扩增结果送交中国水稻研究所做Hi-TOM测序。
统计测序结果如表1～3所示，PsPDS1的平均编辑效率为8.32％(测序样本数125，突变数10)，共有7种突变类型，其中6种突变类型为缺失，1种突变类型为插入(表1)；PsPDS2的平均编辑效率为0.68％(测序样本数32，突变样本数2)，只有1种突变类型，为插入(表2)；PsPDS3的平均编辑效率为3.90％(测序样本数55，突变样本数12)，共有3种突变类型，全部为缺失(表3)
表1 PsPDS1的具体突变情况
表2 PsPDS2的具体突变情况
表3 PsPDS2的具体突变情况
对比例1
将实施例1中的PsPDS1、PsPDS2、PsPDS3靶标分别连接在水稻中适用的CRISPR/Cas9基因编辑骨架载体PHUC 411-OsU3-SpR-sg2.0-ZmUBI-OsCas9-t35sT中，得到PHUC411-OsU3-PsPDS1-sg2.0-ZmUBI-OsCas9-t35sT、PHUC 411-OsU3-PsPDS2-sg2.0-ZmUBI-OsCas9-t35sT、PHUC 411-OsU3-PsPDS3-sg2.0-ZmUBI-OsCas9-t35sT基因编辑载体，分别转化到发根农杆菌感受态细胞K599中，进行遗传转化，约4w后长出毛状根，提取毛状根的DNA，PCR扩增靶标区域，并将扩增结果送交中国水稻研究所做Hi-TOM测序。
统计测序结果如表4所示，PHUC-PsU6p3-PsPDS1-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT、PHUC-PsU6p3-PsPDS2-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT、PHUC-PsU6p3-PsPDS3-sg2.0-en35sPsCas9-t35sT载体，突变类型少且平均编辑效率低。
表4 3个PsPDS靶点的突变情况
对比例2
将CRISPR/Cas9基因编辑骨架载体PHUC 411-OsU3-SpR-sg2.0-ZmUBI-OsCas9-t35sT中的OsU3、ZmUBI和OsCas9元件分别用AtU626、en35S和PsCas9替换下来，并将PsPDS1、PsPDS2、PsPDS3靶标连接到改造后的载体中，得到PHUC-AtU626-PsPDS1-sg2.0-en35S-OsCas9-t35sT、PHUC-AtU626-PsPDS2-sg2.0-en35S-OsCas9-t35sT和PHUC-AtU626-PsPDS3-sg2.0-en35S-OsCas9-t35sT，分别转化到发根农杆菌感受态细胞K599中，进行遗传转化，约4w后长出毛状根，提取毛状根的DNA，PCR扩增靶标区域，并将扩增结果送交公司做Hi-TOM测序。
统计测序结果如表5所示，PHUC-PsU6p3-PsPDS1-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT、PHUC-PsU6p3-PsPDS2-sg2.0-en35s PsCas9-t35sT和PHUC-PsU6p3-PsPDS3-sg2.0-en35sPsCas9-t35sT载体，突变类型更少且平均编辑效率更低。
表5 3个PsPDS靶点的突变情况
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4248
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ctgcaggcca ccatggcccc aaagaagaag cgcaaggtcg ataagaagta ctctattgga 60
cttgatattg gtacaaattc agttggatgg gcagttatta ctgatgaata caaggttcct 120
tctaagaaat tcaaggtttt gggtaacaca gatagacatt caattaagaa aaatcttatt 180
ggagctttgt tgttcgattc tggtgaaact gctgaagcaa caagacttaa gagaactgca 240
agaagaagat acacaagaag aaagaacaga atttgttatt tgcaagaaat ttttagtaat 300
gaaatggcta aggttgatga ttctttcttt catagattgg aagaatcatt tcttgttgaa 360
gaagataaga agcatgaaag acatccaatt ttcggaaaca ttgttgatga agttgcttac 420
catgaaaagt accctacaat ttaccatttg agaaagaaac ttgttgattc tactgataag 480
gcagatctta gattgattta ccttgctttg gcacatatga ttaagttcag aggacatttt 540
cttattgaag gtgatcttaa cccagataac tcagatgttg ataaattgtt cattcaactt 600
gttcaaacat ataatcaact ttttgaagaa aatcctatta atgcttctgg agttgatgct 660
aaggcaattt tgtcagcaag actttctaag tcaagaagac ttgaaaactt gattgctcaa 720
ttgccaggtg aaaagaaaaa tggattgttc ggtaacctta ttgcactttc tttgggtctt 780
acacctaact tcaagtcaaa cttcgatctt gctgaagatg caaagttgca actttctaag 840
gatacttacg atgatgattt ggataatctt ttggctcaaa ttggtgatca atatgcagat 900
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