新型微塑料降解酶的微生物合成及性能研究
摘要
微塑料的污染日益严重,解决方式之一是对塑料进行生物降解,能节约资源,缓解塑料带来的环境威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种产量巨大的石油基塑料,常常被用作包装材料或者纺织品,回收利用率不高,被随意丢弃在环境中,造成资源的浪费且污染环境。提高PET的生物降解效率,回收得到PET的单体,能实现PET的循环利用,缓解资源匮乏现状,减轻环境压力。本文以目前PET降解效率最高的角质酶ICCG为研究对象,建立了PET降解产物对苯二甲酸(PTA)的高效液相色谱检验方法,构建了全新的表达ICCG的基因工程菌,优化了工程菌的自诱导培养基,对ICCG的酶学性质进行了探究,得出的结果如下:(1)在对PET降解产物对苯二甲酸(PTA)建立离子抑制色谱检测方法,其优化后色谱条件为:乙腈-水=13%-87%(v:v);乙酸调节流动相p H=3.00;流速:1.0 m L/min;进样体积:5μL;检测波长:242 nm;温度:室温。(2)利用基因工程技术,构建了新的基因工程菌E.coli BL21-p ET22b-ICCG,能正常表达具有活性的PET降解酶ICCG,且该工程菌不适合利用IPTG诱导的LB培养基、适合乳糖诱导的自诱导培养基。(3)利用单因素和曲面响应实验优化ZYM自诱导培养基的主要碳源成分(葡萄糖、甘油、乳糖),响应面优化结果为:葡萄糖1.75g/L、甘油11.5g/L、乳糖7.51g/L时,该浓度下重组大肠杆菌上清液活性比原始ZYM自诱导培养基培养提高了约56.53%。(4)对ICCG的酶学性质进行研究,其温度活性范围为40℃-90℃,最佳反应温度是72℃。最佳反应p H是8.00,p H低于5时几乎不反应,反应条件偏碱性。在50m L反应体系,ICCG浓度一定时,底物PET添加量为0.1g时具有较高的降解效率和PET降解率(ICCG浓度为0.46mg/L,PET完全降解率为5.36%)。考察7种金属离子(Ca2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Zn2+)对ICCG催化活性的影响时,发现5m M的Ca2+有助于ICCG的催化作用,高浓度的Mn2+、Mg2+、Co2+、Cu2+可能对ICCG活性有激活作用,微量的Fe2+可能对ICCG活性有激活作用,Zn2+对ICCG催化活性整体呈抑制作用。有机试剂(甲醇、乙醇、乙腈)对ICCG催化活性影响整体较小,5%-10%的甲醇和5%的乙醇对ICCG的活性有激活作用,但整体上乙腈对ICCG活性有微弱抑制,可能存在某乙腈浓度对ICCG活性有激活作用。表面活性剂甘油在5%-10%下对ICCG活性有一定程度的激活作用,蛋白变形剂脲整体上对ICCG活性有不同程度的抑制,EDTA在5m M时对ICCG有明显的激活作用。此外,ICCG具有较高的热稳定性,在最适温度下孵育,其活性整体高于未孵育状态(低温保存),并且孵育20h后,ICCG活性仍保持较高状态。综上,本文建立了对苯二甲酸的检验方法,可为后续表征PET降解效率提供参考;构建了新的ICCG基因工程菌,优化了工程菌的发酵培养基,可为ICCG的量化生产提供帮助;对ICCG的酶学性质进行了详细探究,可为未来优化PET降解效率提供一定的理论支持。展开▼
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