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噁霉灵微球剂的制备及对黄瓜猝倒病的防治效果

花匠小妙招
2024-11-14 07:15

土传病害是由真菌、细菌、线虫等病原体在土壤中侵染作物根茎而引发的病害，常发生于温室大棚中，主要为害瓜类、豆类、茄科等作物。其发生原因主要为连作、施肥不当、土壤酸化和盐渍化等。土传病害的发生隐蔽性和传染性较强[1]，一旦发病会造成作物大面积枯萎、减产甚至绝收。同时土传病害的防治也比较困难，主要以土壤消毒、种子消毒等预防措施为主，发病后化学防治效果较差。瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)属于腐霉科腐霉属藻菌，能引起黄瓜苗期猝倒病[2]、番茄根腐病[3]等多种土传病害。其引起的黄瓜猝倒病是温室苗床中最常见的病害，发病率高达20%~50%[4]，发病后会造成严重的经济损失。因此研究开发可高效抑制瓜果腐霉病菌的药剂对黄瓜苗期猝倒病防治具有重要的意义。

噁霉灵是高效的内吸型杀菌剂和土壤处理剂，同时兼具一定的植物生长调节功能。其水溶性良好，25 ℃时在水中的溶解度可达85 g/L。噁霉灵能有效抑制真菌孢子萌发和菌丝体的正常生长，对瓜果腐霉病菌抑制活性较强，因此对黄瓜猝倒病具有良好的防治效果[5]。目前噁霉灵的登记剂型主要为水剂、可湿性粉剂和颗粒剂，主要使用方法为兑水稀释后进行种子消毒或灌根。种子处理虽然能减少种子本身携带的病原体，并给予种子一定的保护能力，但对土壤中病原体的杀灭能力不足；灌根常用于发病后的治疗，但由于土壤淋溶作用导致防治效果不佳，使得短时间内需多次大量施药，导致药剂大量流失，并可能对非靶标生物产生较大危害。因此，开发一种高效、省力、具有缓释功能的噁霉灵新剂型，从而降低其土壤淋溶作用，是充分发挥噁霉灵药效的新思路。

微球是一种新兴的载药体系，指将药物溶解后，吸附或包埋在由高分子材料制成的微米尺度球状颗粒中，以实现对药物的负载，并具有缓释及控释的效果。目前已有多种材料制成的微球被广泛应用于医药研究中[6-8]。在农药领域，将农药有效成分包封于微球中可以提高药剂稳定性，降低农药对非靶标生物的毒性、延长持效期、提高附着能力，从而提高农药利用率。作为新兴农药缓控释剂型，农药微球剂 (MS) 已成为当前的研究热点。目前，成熟的微球制备材料和交联剂多为人工合成化合物，具有较高的环境风险，因此，绿色、低毒、天然可降解载体材料和交联剂的研究开发有利于推动微球剂在农药领域的应用。

壳聚糖是从虾壳中提取的天然高分子化合物，是自然界唯一的弱碱性氨基多糖，具有一定的水溶性、抑菌活性和生物相容性[9]。壳聚糖可与多种化合物通过简单的反应产生交联，形成具有较大比表面积和较多孔隙的微球[10]或水凝胶[9]，是良好的载体材料，且可以通过功能化修饰进一步提高其性能。目前壳聚糖作为载体材料已在食品[11-15]、医药[6,16-18]及化妆品[19-21]等领域得到广泛应用。然而，传统的用于制备壳聚糖微球的交联剂如戊二醛、甲醛、环氧化物等多为生物相容性差的化学合成物质，通常具有较强的细胞毒性[22]，在制备微球的过程中，未反应的交联剂残留在微球中随药物一同释放，可能会造成严重的环境风险。因此，寻找绿色安全的交联剂，是发挥壳聚糖作为载体材料优势的关键。

京尼平是从栀子果实中提取的天然产物，也是中药杜仲中有效成分京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物。具有良好的生物相容性和较低的毒性，其细胞毒性是传统交联剂戊二醛的万分之一[23]。京尼平分子中有两个反应位点可与壳聚糖分子中的氨基发生化学反应，从而实现交联。交联后的微球具有缓释及控释性能，生物相容性高，且环境风险低。

因此，本研究拟以壳聚糖为载体材料、京尼平为交联剂制备载体微球，并探究其对水溶性杀菌剂的负载方法；以噁霉灵为模式药物制备载药微球，并对其缓控释性能和抑菌活性进行探究，以期得到能预防土传病害的绿色低毒、安全高效、具有响应释放功能的噁霉灵微球剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖 (chitosan，CS，脱乙酰度>95%，低黏度，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；京尼平 (genipin，纯度98%，上海毕得医药科技股份有限公司)；戊二醛 (glutaric dialdehyde，GD，50%水溶液，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；液体石蜡 (化学纯)及Span-80 (国药集团化学试剂有限公司)；石油醚 (沸点60~90 ℃，北京市通广精细化工有限公司)；冰醋酸 (化学纯，天津市致远化学有限公司)；噁霉灵原药 (hymexazol TC，纯度98.5%，沈阳中化农药化工研发有限公司)；恶霉灵标准品 (纯度99%，北京宇悦生物科技有限公司)；自制噁霉灵水剂 (hymexazol AS，含量30%)；市售噁霉灵水剂 (30%，山东邹平农药有限公司)；黄瓜种子 (旱宝5号，京研益农 (北京) 种业科技有限公司)；瓜果腐霉病菌 (Pythium aphanidermatum，中国农业大学植物保护学院提供)；海拉细胞 (中国农业大学生命科学学院提供)。

恒温磁力搅拌器 (上海司乐仪器有限公司)；激光粒度仪 (Bettersize 2000B，丹东百特仪器有限公司)；冷冻干燥机 (上海比朗仪器制造有限公司)；傅里叶红外光谱仪 (Spectrum100，美国PerkinElmer)；动态光散射仪 (Zetasizer nano ZS，英国Malvern)；LC-20AT高效液相色谱仪 (HPLC，日本岛津公司)；STA6000热重分析仪 (美国PerkinElmer公司)；SU8010扫描电镜 (日立 (中国) 有限公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 微球剂制备 1.2.1.1 京尼平交联壳聚糖微球的制备

通过反相乳液聚合法[10]制备京尼平交联壳聚糖微球(CS-genipin)。将3 g Span-80和60 g液体石蜡混合均匀作为油相，将0.1 g京尼平完全溶解于10 g 2%的壳聚糖溶液中作为水相；搅拌下将水相逐滴加入油相中；继续搅拌乳化1 h，升温至50 ℃，反应8 h。反应结束后离心收集微球，石油醚洗3次，冷冻干燥24 h，备用。

1.2.1.2 京尼平交联壳聚糖微球的表征

在显微镜和扫描电镜下观察京尼平交联壳聚糖的外观形貌特征。采用溴化钾压片法，于傅立叶红外广谱仪下400~4000 cm−1范围内进行扫描，分别测定干燥的壳聚糖、京尼平及京尼平交联壳聚糖微球的红外吸收光谱。利用X射线衍射仪分析壳聚糖、京尼平及京尼平交联壳聚糖微球的结构，使用动态光散射仪测量壳聚糖交联前后Zeta电位的变化，通过激光粒度仪测量京尼平交联壳聚糖微球的粒径。

1.2.1.3 两种不同方式负载噁霉灵的微球剂的制备

8%噁霉灵水溶液配制：称取4 g噁霉灵原药 (按有效成分折百含量计算)，加入至46 mL蒸馏水中，超声使其完全溶解，备用。

吸附载药微球(CS-genipin (A))的制备：将1.2.1.1节中制得的京尼平交联壳聚糖微球超声分散至自制的8%噁霉灵水溶液中，机械搅拌3 h，用220 nm滤膜砂芯过滤，少量蒸馏水冲洗后冷冻干燥24 h。

包封载药微球(CS-genipin (E))的制备：在1.2.1.1节方法中的2%壳聚糖溶液中，直接加入适量的噁霉灵原药，其他操作与1.2.1.1节相同。

1.2.1.4 两种载药微球的表征

在显微镜和扫描电镜下观察两种载药微球的外观形貌特征。采用溴化钾压片法，于傅立叶红外广谱仪下400~4000 cm‒1范围内进行扫描，分别测定干燥的噁霉灵原药和两种载药微球的红外吸收光谱。利用热重分析仪对噁霉灵原药、京尼平交联壳聚糖微球和两种载药微球的热分解过程进行表征，分析壳聚糖、京尼平、京尼平交联壳聚糖微球及两种载药微球的结构。使用动态光散射仪测量壳聚糖交联前后Zeta电位的变化，通过激光粒度仪测量两种载药微球的粒径。

1.2.1.5 两种不同负载方式的载药量测定

标准样品溶液的配制：取0.1 g噁霉灵标准样品于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇，超声萃取30 min，使固体颗粒完全溶解，恢复室温后用甲醇定容。取1 mL溶液，过0.22 µm滤膜后，采用HPLC进行含量测定。

两种载药微球样品溶液的配制：分别取1 g两种载药微球固体颗粒于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇，超声萃取30 min，使固体颗粒完全分散，药物释放溶解到甲醇中，恢复室温后用甲醇定容。取1 mL溶液，过0.22 µm滤膜后，采用HPLC进行含量测定。

HPLC检测条件：Agilent C18色谱柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：V(甲醇) : V(水)=60 : 40；流量l mL/min；进样体积10 μL；柱温30 ℃；检测波长230 nm。

通过公式(1)计算载药量 (ω，%)。

$$ omega /{text{%}}=frac{{A}_{2}times {m}_{1}times C}{{A}_{1}times {m}_{2}}times 100 $$ (1)

式中，A1、A2分别为标样溶液和试样溶液中噁霉灵峰面积的平均值；m1、m2分别为称取的噁霉灵标样和载药微球的质量 (g)，C为噁霉灵原药的含量 (%)。

1.2.2 两种方式载药微球在不同pH下的释放试验

采用透析法测定两种载药微球的释放速率。根据pH条件分别准备以下释放介质：pH=5的释放介质为HAc-NaAC缓冲溶液，pH=7的释放介质为蒸馏水，pH=9的释放介质为NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液。将50 mg载药微球加入已湿润的透析袋中，两端扎紧，放入盛有200 mL释放介质的具塞磨口锥形瓶中，持续搅拌。每1 h取锥形瓶中1 mL释放介质，过0.22 µm滤膜，装入进样小瓶备用。每次取样后，向锥形瓶中再加入1 mL新鲜的释放介质，保证释放体系始终处于非饱和状态。利用HPLC分析测定样品中噁霉灵的含量，并通过公式(2)计算载药微球中噁霉灵的累计释放量。

$$ {M}_{t}=({c}_{t} + frac{1}{V}{sum} _{0}^{t-1}{c}_{t})times V $$ (2)

式中，Mt为t时刻噁霉灵的累计释放量 (g)；ct为t时刻溶液中噁霉灵的浓度 (g/L)；V为锥形瓶中释放介质的总体积 (L)。

利用Origin软件绘制两种载药微球在不同pH下的释放曲线，引入以下3种释放动力学模型，分别对两种载药微球在不同pH下的释放行为进行模型拟合，根据回归方程决定系数R2的大小，确定两种载药微球在不同pH下符合的释放动力学模型。

零级动力学方程：

$$ frac{{M}_{t}}{{M}_{z}}=kt $$ (3)

一级动力学方程：

$$ mathrm{ln}left(1-frac{{M}_{t}}{{M}_{z}}right)=-kt $$ (4)

Higuchi方程：

$$ frac{{M}_{t}}{{M}_{z}}=k{t}^{frac{1}{2}} $$ (5)

式中，Mt为t时刻噁霉灵的累计释放量；Mz为噁霉灵的总释放量；k为释放动力学常数。

1.2.3 土柱淋溶试验

分别取0.3 mL 市售的30%噁霉灵水剂、0.6 g包封载药微球和0.6 g吸附载药微球，与15 g土壤基质拌匀后装填至玻璃柱中，填柱高度约30 cm，在土柱顶部覆盖一层1 cm厚石英砂。用200 mL蒸馏水作为滤液进行淋洗 (图1)。控制柱子底部液体滴速为1滴/s，收集全部滤液，称重并通过HPLC测定滤液中噁霉灵的含量，计算出淋滤后土壤中噁霉灵的含量。根据两种载药微球土壤处理后噁霉灵在土壤中的持留能力，结合1.2.1.5节中测定的两种载药微球的释放性能，确定噁霉灵微球剂的优选制备方法。

图 1 土壤淋滤试验装置图

Figure 1. Soil column leaching experiment equipment

1.2.4 离体杀菌活性测定

采用菌丝生长速率法测定噁霉灵原药(HY TC)和噁霉灵微球剂(HY MS)对瓜果腐霉病菌的杀菌活性。通过梯度稀释法，配制含不同质量浓度有效成分的噁霉灵原药和噁霉灵微球剂的PDA培养基，培养基中有效成分终浓度分别为1、5、10、25、50和100 mg/L。分别以无菌水和不含药的京尼平交联壳聚糖微球为对照组。将上述配制好的含药培养基冷却至50 ℃后倒入培养皿中，冷却凝固后接种菌饼，置于27 ℃培养箱中培养，每天观察，待无菌水对照组刚刚长满培养皿时统计药效。每个处理组重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

1.2.5 噁霉灵微球剂对黄瓜猝倒病的盆栽防效试验

将30 g麦麸和一定量的蒸馏水混合至刚好湿润无多余水分，加入至500 mL的锥形瓶中，麦麸体积不超过锥形瓶总体积的1/3，湿热灭菌后备用。将瓜果腐霉病菌接种至新鲜配制的麦麸培养基中培养7 d后，与营养土混合制成毒土，备用。黄瓜种子在有湿润纱布的培养皿中、30 ℃黑暗环境下催芽24 h后，将发芽种子移栽至装有营养土的花盆中进行预培养。待幼芽生长至5 cm高时，再将其移栽至准备好的噁霉灵微球剂毒土花盆中，并在28 ℃、相对湿度为30%的温室中培养。试验设置3个对照组：市售噁霉灵水剂(HY AS)灌根处理为药剂对照组；未使用毒土培养的为阴性对照；使用毒土培养但不施药的为阳性对照。各试验组的药剂浓度如表1所示，每处理重复5次。移栽后持续观察幼苗的生长情况，并在移栽后第7天和第14天记录黄瓜幼苗生长高度及猝倒病发生情况。

表 1 噁霉灵微球剂防治黄瓜猝倒病盆栽试验中不同处理组病菌接种情况及施药浓度

Table 1. Inoculation of bacteria and application concentration of formulations in different treatment groups in the pot experiments of hymexazol MS controlling cucumber dumping-off.

试样
Samples 是否接种
瓜果腐霉病菌
Inoculated
or not 施药剂量
Dosage/(mg a.i./plant) 低剂量
Low dosage 高剂量
High dosage 噁霉灵微球剂
hymexazol MS 是
Inoculated 9 90 噁霉灵水剂
hymexazol AS 是
Inoculated 9 90 阳性对照
Positive control 是
Inoculated — — 阴性对照
Negative control 否
Non-inoculated — — 1.2.6 噁霉灵微球剂的细胞毒性试验

利用PBS缓冲液分别配制40 mg/mL的壳聚糖溶液(CS)、京尼平交联壳聚糖微球(CS-genipin)悬浮液和戊二醛交联壳聚糖微球(CS-GD)悬浮液10 mL，高压灭菌后备用。

利用CCK-8法[24-25]测定上述样品对海拉细胞的毒性。取2个96孔板，分别加入100 µL细胞悬浮液(10000个海拉细胞)，在培养箱中预培养24 h后，处理组每孔中加入10 µL待测溶液，空白对照组、对照组中加入10 µL PBS缓冲液。每个处理重复6次。加样后将培养板放入培养箱中分别培养24 h和48 h后，每孔加入10 mL CCK-8溶液，再放入培养箱中孵育2 h，用酶标仪测量每孔中溶液在450 nm处的吸光度值，通过公式(6)计算细胞存活率 (RS，%)。

$$ {R}_{S}/{text{%}}=frac{mathrm{O}mathrm{D}-{mathrm{O}mathrm{D}}_{mathrm{B}mathrm{l}mathrm{a}mathrm{n}mathrm{k}}}{{mathrm{O}mathrm{D}}_{mathrm{C}mathrm{o}mathrm{n}mathrm{t}mathrm{r}mathrm{o}mathrm{l}}-{mathrm{O}mathrm{D}}_{mathrm{B}mathrm{l}mathrm{a}mathrm{n}mathrm{k}}}times 100 $$ (6)

式中，OD为处理组吸光度的平均值；ODBlank为空白对照组吸光度的平均值；ODControl为对照组吸光度的平均值。

1.2.7 噁霉灵微球剂对蚯蚓的急性毒性试验

采用蚯蚓急性毒性试验模式物种赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)进行评估，人工土壤基质配制及试验操作均按照国家标准GBT 21809―2008《化学品蚯蚓急性毒性试验》进行。

分别将噁霉灵微球剂分散至去离子水中、市售30%噁霉灵水剂用去离子水稀释后，在1L的烧杯中与750g人工土壤混合，制成药剂有效成分含量分别为1500、2000、2500和3000 mg/kg (干土)的试验基质。每个烧杯中放入10条干净蚯蚓，用带有小孔的塑料盖盖好以防止试验基质变干。以不添加药剂的人工土壤组为对照，每个处理重复3次。在20 ℃、相对湿度80%、持续光照环境下培养。整个试验周期为14 d，分别在第7天和第14天统计蚯蚓的死亡率：第7天时将烧杯中的试验基质轻轻倒出，取出蚯蚓，检验蚯蚓前尾部对机械刺激的反应，当蚯蚓受到机械刺激无反应时视作死亡；检查结束后及时移除死亡的蚯蚓，将试验基质和蚯蚓重新置于烧杯中继续培养，第14天时再进行相同的检查。

1.3 数据处理

本研究中所有数据均采用SPSS 27进行处理分析；药剂对瓜果腐霉病菌的EC50值由概率回归模型计算。通过Duncan’s 检验 (P<0.05) 分析数据的差异显著性，并表示为平均值 ± 平均值的标准误差 (SEM) 形式。相关图片均利用Origin 2021绘制。

2 结果与分析

2.1 京尼平交联壳聚糖微球的FTIR、XRD和Zeta电位分析

图式1为制备京尼平交联壳聚糖的反应机理。京尼平能与壳聚糖分子上的氨基发生两种不同的反应：1) 壳聚糖分子中的氨基亲核进攻京尼平分子中的C3烯碳原子后开环，形成的亚胺和醛基进行席夫碱反应，闭环形成杂环氨基化合物。2) 壳聚糖分子中的氨基与京尼平中的酯基发生亲核取代反应，形成酰胺。上述两种反应同时进行，可使壳聚糖长链之间相互连接，从而实现交联，因此可以通过红外光谱中官能团特征峰的变化来判断壳聚糖与京尼平是否通过化学反应发生了交联。

图式 1 京尼平交联壳聚糖的反应机理

Scheme 1. The reaction mechanism of the cross-link of Genipin and chitosan

图2a为京尼平(Genipin)、壳聚糖(CS)和京尼平交联壳聚糖微球(CS-genipin)的红外光谱图。在京尼平的红外光谱中，3399 cm‒1和3239 cm‒1分别对应京尼平分子中两个羟基的O―H伸缩振动；1682 cm‒1和1301 cm‒1分别为酯基中C＝O和C―O伸缩振动；1622 cm‒1和880 cm‒1分别对应杂环上的C＝C伸缩振动和＝C―H弯曲振动；1204 cm‒1对应杂环中的C―O伸缩振动。在壳聚糖和CS-genipin的红外光谱图中，均有3366 cm‒1、2919 cm‒1和1383 cm‒1等吸收峰。其中，3366 cm‒1附近的强宽吸收峰是壳聚糖中O―H和N―H伸缩振动，此峰在CS-genipin的红外光谱图中发生了红移，主要是由于京尼平与壳聚糖交联形成席夫碱后产生了π键，导致环上电子云密度增大并与羟基中的氢原子缔合，使羟基的伸缩振动峰发生红移；2919 cm‒1为壳聚糖残糖基上甲基和亚甲基的伸缩振动峰；1383 cm‒1为壳聚糖甲基中C―H键变形的振动吸收峰。1655 cm‒1和1602 cm‒1处分别为壳聚糖中C＝O伸缩振动峰和C―N―H面内弯曲振动峰，表明壳聚糖未完全脱乙酰化。在CS-genipin的红外光谱中，1602 cm‒1附近特征吸收峰削弱，1655 cm‒1附近特征吸收峰增强，证明壳聚糖与京尼平交联后形成了大量的酰胺键，由于京尼平分子结构比乙酰基中的甲基体积大，削弱了C―N―H的面内弯曲振动。通过以上分析，证明壳聚糖与京尼平已通过化学反应成功交联。

图 2 京尼平交联壳聚糖微球的结构表征

a. 红外光谱图；b. X射线衍射图；c. 壳聚糖和CS-genipin的Zeta电位图；d. CS-genipin扫描电镜图。

Figure 2. Structural characterization of CS-genipin

a. FTIR; b. XRD; c. Zeta of CS and CS-genipin; d. SEM of CS-genipin.

图2b为壳聚糖和CS-genipin的Zeta电位图。壳聚糖水溶液由于氨基质子化而带正电，电势为76 mV。当壳聚糖与京尼平交联后，由于氨基被消耗，导致电势降低至12 mV，证明氨基与京尼平通过化学反应实现了交联；反应后电势仍为正值，说明在交联过程中，氨基未完全反应。

图2c为壳聚糖、京尼平和CS-genipin的X射线衍射图，京尼平在2θ=11.72°、18.3°、19.7°、22.1°、26.3° 等处有强衍射峰，而在CS-genipin中则没有上述的强衍射峰，仅在2θ=20.2° 处有壳聚糖的典型宽峰。这也证明了京尼平与壳聚糖并不是简单的混合，而是发生了化学反应。

图2d为CS-genipin的扫描电镜图，可见所制备的微球呈表面光滑的规则球形，通过激光粒度仪测得该微球的中值粒径 (D50) 为5.73 μm。

2.2 两种载药微球的制备及FTIR和TGA分析

本研究通过包封和吸附两种方式，分别实现了水溶性药物噁霉灵(hymexazol, HY)在CS-genipin中的负载。如图3所示，包封载药微球(HY@CS-genipin (E))的制备是将噁霉灵与壳聚糖和京尼平混合作为水相，通过反相乳液聚合法一锅制成；吸附载药微球(HY@CS-genipin (A))则是通过将制备好的CS-genipin悬浮在噁霉灵水溶液中，通过CS-genipin表面的羟基与噁霉灵上的羟基形成氢键，将药物吸附在微球的表面。

图 3 包封和吸附载药示意图

Figure 3. Schematic diagram of drug-carrying by encapsulation and absorption

图4a的红外光谱图中，两种载药微球在1636 cm‒1处均有噁霉灵异噁唑环上的C＝N吸收峰，证明了两种载药微球对噁霉灵均已成功负载。CS-genipin中3407 cm‒1处的O—H键伸缩振动吸收峰，在吸附载药微球 (HY@CS-genipin (A)) 中发生了红移，这是由于在两个羟基间形成氢键后，O—H键伸长，导致其伸缩振动峰红移。这也证明了噁霉灵通过氢键相互作用吸附在CS-genipin表面，从而实现了对药物的负载。

图 4 两种载药微球的红外光谱、热重分析曲线和扫描电镜图

a. 红外光谱图；b. 热重分析曲线；c. 吸附载药微球的扫描电镜图；d. 包封载药微球的扫描电镜图。

Figure 4. FTIR spectra, TG-DTG curve and SEM image of HY@CS-genipin (A) and HY@CS-genipin(E)

a. FTIR; b. TG-DTG; c. SEM images of drug-loaded microspheres; d. SEM images of encapsulated drug-loaded microspheres.

所制备的包封载药微球 (HY@CS-genipin (E)) D50值为6.42 µm，载药量为15.87%；吸附载药微球D50值为6.69 µm，载药量达到18.63%。两种载药微球的粒径接近，均略大于未载药CS-genipin的D50 值5.73 µm。包封载药微球的载药量略低于吸附载药微球，主要归因于包封载药微球的包封率较低，在本研究的投料量下，包封率仅为28.30%，大部分原药在材料的交联过程中并未被包埋，导致了载药量较低；而吸附载药微球虽然有较高的载药量，但需要将制备好的微球重新悬浮在噁霉灵水溶液中搅拌并过滤、烘干，操作步骤相对更繁琐。

图4b为噁霉灵原药、CS-genipin和两种载药微球的热重分析 (TG-DTG) 曲线。由图中可知：噁霉灵原药的热分解过程为一步分解，于140 ℃左右开始分解，220 ℃分解完全；CS-genipin的热分解主要分为3个阶段，第一阶段为95.2 ℃附近，CS-genipin脱去其所携带水分；第二阶段为160 ℃至390 ℃区间，壳聚糖大分子降解，壳聚糖单元脱水分解，氧化燃烧，质量不断下降；第三阶段为380 ℃以上，主要为残余物质的氧化、燃烧。

与载体微球CS-genipin相比，两种载药微球的热分解行为几乎相同，仅在第二阶段有更高的质量损失，并在220 ℃左右出现高速质量损失，表明在此阶段噁霉灵原药发生了分解。因此通过热重分析曲线进一步证明，所制备的两种载药方式微球均成功负载了噁霉灵。

2.3 载药微球的释放性能

图5为在pH=7的水溶液中吸附载药微球和包封载药微球的释放曲线。对于吸附载药微球，由于药物通过氢键吸附在微球表面，在释放过程中，水分子通过破坏噁霉灵分子与CS-genipin之间的氢键使噁霉灵释放，因此其释放速率较快，达到平衡的时间短，且在达到平衡前，释放速率没有出现明显的变化。包封载药微球中药物大部分位于微球内部，分布不均匀，小部分位于微球的表面，包封载药微球主要通过水的渗透萃取和微球破裂使药物释放，因此在前期释放速率较快，主要是吸附在微球表面和包埋在微球浅层的噁霉灵的释放，随释放时间延长，释放速率有所降低，包埋在微球内部的噁霉灵逐渐释放，直至达到平衡。两种载药微球释放达到平衡后的累计释放率均超过90%，其中：吸附载药微球释放速率较快，12 h累计释放率为89.77%，且基本达到平衡，累计释放率约为93%；而包封载药微球12 h累计释放率为71.56%，48 h后达到平衡，累计释放率达到96%左右。

图 5 pH=7的水溶液中吸附载药微球和包封载药微球的释放曲线

Figure 5. Cumulative release rate of HY@CS-genipin (A) and HY@CS-genipin (E) in water with a pH of 7

壳聚糖在碱性条件下易水解，断链形成小分子，而在酸性条件下则能稳定存在，因此，以壳聚糖为材料制备的载体微球通常具有pH响应释放的功能[26]。本研究探究了两种载药微球在不同pH值水溶液中的释放。对于包封载药微球 (图6a)，在pH=5时，壳聚糖降解速率较慢，微球破裂所需时间增加，有效成分释放速率变慢；而当pH=9时，由于碱性环境可加速壳聚糖长链断裂，加快微球的崩解，从而促进了有效成分的释放。由图6中可看出，虽然吸附载药微球的释放速率明显快于包封载药微球，但在中性和碱性条件下，两种载药方式微球的释放规律基本相同。对吸附载药微球 (图6b) 而言，在酸性条件下，由于H+ 会夺取噁霉灵中的羟基，使噁霉灵与CS-genipin之间的氢键断裂，从而加速了噁霉灵的释放。此外，由于在吸附载药微球中，酸性条件对药物脱附的影响要强于碱性条件下壳聚糖水解对释放的影响，因此，在pH=5的条件下，吸附载药微球具有最快的释放速率。

图 6 两种载药微球在不同pH水溶液中的释放曲线

a. 包封载药微球 (HY@CS-genipin (E) )；b. 吸附载药微球 (HY@CS-genipin (A) )。

Figure 6. Cumulative release rate of HY@CS-genipin (A) and HY@CS-genipin (E) in water with different pH

通过引入3种释放动力学模型 (零级释放模型、一级释放模型和Higuchi模型)，对两种载药微球在不同pH水溶液中的释放行为进行拟合，研究两种微球在不同pH条件下的释放动力学，结果(表2)表明，两种不同载药方式微球在不同pH条件下的释放均符合一级释放动力学方程，R2均大于0.96。

表 2 HY@CS-genipin (A) 和HY@CS-genipin (E) 在不同pH水溶液中的释放动力学模型拟合

Table 2. The cumulative release rate of HY@CS-genipin (A) and HY@CS-genipin (E) in water with different pH fitting by release kinetics model

释放动力学模型
Release kinetics model公式
FormulaR2HY@CS-genipin (A)HY@CS-genipin (E)pH=5pH=7pH=9pH=5pH=7pH=9 零级动力学
Zero-order kineticsMt/Mz=kt0.12340.34860.19650.76300.72070.4110一级动力学
First-order kineticsln(1‒ Mt/Mz)=‒kt0.98370.99290.97280.96090.96380.9938Higuchi方程
Higuchi equationMt/Mz=kt1/20.29100.55670.35720.94160.91990.6660 2.4 土壤处理后噁霉灵在土壤中的持留性

本研究通过土柱淋溶试验，探究了吸附载药微球、包封载药微球和噁霉灵水剂经土壤处理后，在雨水或灌溉条件下有效成分在土壤中的持留特性。结果表明：土壤处理2 h后，噁霉灵水剂组有效成分流失量达到98.63%，吸附载药微球组有效成分流失量为86.18%，而包封载药微球处理组有效成分流失量仅为4.33%；土壤处理7 d后，包封载药微球处理组累计有效成分流失量为67.69%，仍明显低于噁霉灵水剂处理组。

综合2.3节及2.4节的试验结果，对比噁霉灵水剂、吸附载药微球和包封载药微球可发现：本研究制备的两种微球均有一定的缓控释效果，且包封载药微球的缓释速度要慢于吸附载药微球；土壤处理后，包封载药微球能大幅提高有效成分在土壤中的持留，显著降低雨水冲刷或灌溉后有效成分在土壤中的流失，从而提高农药的利用率，符合绿色环保农药的要求。因此，本研究确定采用上述包封载药微球制备方式制备噁霉灵微球剂，并对其生物活性进行了探究。

2.5 噁霉灵微球剂的离体抑菌活性

图7显示了不同浓度的噁霉灵原药和噁霉灵微球剂对瓜果腐霉病菌的活性。PDA培养基中菌丝生长速率结果表明，两个处理组的抑菌率均与药剂浓度呈正相关；将两个处理组的抑菌率与浓度对数进行线性拟合 (图8)，R2分别为0.9759和0.9588，相关性良好。其中噁霉灵原药的EC50值为14.85 mg/L，而噁霉灵微球剂的EC50值为18.96 mg/L，表明在有效成分浓度相同时，噁霉灵微球剂的药效与噁霉灵原药相当。噁霉灵微球剂的EC50值略高于噁霉灵水剂，推测是因为原药被包封后，在没有充分液体环境的情况下药效不能完全发挥。

图 7 噁霉灵原药和噁霉灵微球剂对瓜果腐霉病菌菌丝生长的抑制活性

Figure 7. The inhibitory activity of HY TC and HY MS against the mycelium growth of Pythium aphanidermatum

图 8 抑菌率-浓度对数线性拟合结果及95%置信带

a. 噁霉灵原药 (hymexazol TC)；b. 噁霉灵微球剂 (hymexazol MS)。

Figure 8. The results of linear fitting between logarithm of concentration and inhibition rate

表 3 抑制率与有效成分浓度对数的线性拟合结果及EC50值

Table 3. The results of linear fitting between inhibition rate and logarithm of concentration and the EC50 value

试样
Sample 毒力回归方程
Toxic regression equation R2 EC50/(mg/L) 95%置信区间
95% Confidence interval 噁霉灵原药
hymexazol TC y=0.40931x + 0.02036 0.9759 14.85 10.67~21.67 噁霉灵微球剂
hymexazol MS y=0.40393x ‒ 0.01613 0.9588 18.96 12.12~29.85 2.6 噁霉灵微球剂对黄瓜苗期猝倒病的预防作用防效

本研究探究了噁霉灵微球剂和市售噁霉灵水剂对由瓜果腐霉病菌所致黄瓜苗期猝倒病的预防效果。表4结果表明阴性对照组在14 d内均未发病，且植株长势良好。阳性对照组在接菌7 d后，盆中出现大量白色菌丝，幼苗长势不及阴性对照，并随试验时间延长而逐渐枯萎；14 d后，阳性对照组所有植株均发病，茎基部萎缩，子叶萎蔫，植株整体倒伏于盆中。高剂量 (90 mg/株) 下，噁霉灵微球剂和市售水剂对黄瓜苗期猝倒病均有良好的防效，处理14 d后均未观察到感病现象，发病率为0；同时噁霉灵微球剂和水剂处理组平均株高均高于阴性对照，这可能是由于噁霉灵具有一定的植物生长调节作用。表4和图9表明在低剂量 (9 mg/株) 下，两种制剂间存在一定差异，处理后14 d，噁霉灵微球剂组总发病率仅为20%，水剂组总发病率为80%，且微球剂组平均株高显著高于水剂组。处理后14 d，低剂量水剂处理组植株长势明显不及阴性对照和高剂量处理组。

表 4 接种瓜果腐霉病菌后不同处理组黄瓜幼苗的株高及发病率

Table 4. Plant height and incidence rate of cucumber seedling in different treatment group after inoculation

处理
Treatment株高
Plant height/cm发病率
Incidence rate/%7 d14 d7 d14 d 阴性对照 Negative control7.510.200阳性对照 Positive control6.2—0100噁霉灵微球剂
hymexazol MS低剂量 Low dosage7.610.8020高剂量 High dosage7.811.200噁霉灵水剂
hymexazol AS低剂量 Low dosage6.56.8080高剂量 High dosage7.81100

图 9 两种制剂噁霉灵处理后14 d黄瓜幼苗长势

a. 低剂量水剂处理的发病植株；b. 低剂量水剂处理的未发病植株；c. 高剂水剂处理组植株；d. 低剂量微球剂处理的发病植株；e. 低剂量微球剂处理的未发病植株；f. 高剂量微球剂处理组植株。注：低剂量为有效成分9 mg/株，高剂量为有效成分90 mg/株。

Figure 9. Growth of cucumber seedlings after 14 days of treatment with two formulations of hymexazol

a. Low-dose AS-treated morbid plants; b. low-dose AS-treated non-morbid plants; c. high-dose AS-treated group plants; d. low-dose MS-treated morbid plants; e. low-dose MS-treated non-morbid plants; f. high-dose MS-treated group plants. Note: Low dose of active ingredient 9 mg a.i./plant, high dose of active ingredient 90 mg a.i./plant.

试验表明：在有效成分90 mg/株的高剂量处理下，两种噁霉灵制剂均对瓜果腐霉病菌有一定抑制作用，且有一定的生长促进作用，可有效防止黄瓜苗期猝倒病的发生；而在有效成分9 mg/株低剂量下，噁霉灵微球剂对黄瓜苗期猝倒病的防效仍高达80%，并对瓜果腐霉病菌有较好的抑制作用，但噁霉灵水剂仅有20%的防效，且不能抑制瓜果腐霉病菌的生长。产生这种差异的原因主要是试验中需要每2~3 d浇水模拟灌溉，以保证适宜黄瓜生长的土壤湿度。对水剂而言，噁霉灵以分子形式吸附于土壤中，灌溉会导致其溶解于水中并随水分大量流失，在高浓度时，浇水后土壤中噁霉灵的浓度依然能保证对病害的防效，但在低浓度时，土壤中有效成分将不足以抑制病原菌的生长，从而导致植株发病；而对于噁霉灵微球剂，由于噁霉灵分子被包封于微球之中，灌溉后虽然水的渗透作用会使部分噁霉灵分子从微球中释放出来并溶解于水中而流失，但大部分有效成分仍持留于微球中并缓慢释放。这一现象与土柱淋溶试验结果相符。因噁霉灵微球剂在土壤中出色的持留能力，其在有效成分9 mg/株低剂量下处理14 d后，依然能保证对黄瓜猝倒病的防效，从而可显著减少噁霉灵的用量，提高农药利用率。此外，在播种前翻地时将噁霉灵微球剂与肥料一同撒入土壤，就能对土壤产生长效的杀菌消毒作用，省略了种子处理的过程，体现了噁霉灵微球剂高效、持效和省力化的优点，也为土壤消毒和土传病害防治提供了新的思路。

2.7 噁霉灵微球剂载体材料的细胞毒性分析

醛类交联剂常被用于壳聚糖微球的交联，但其细胞毒性较强，对非靶标生物有潜在危害[22]。本研究以京尼平代替传统交联剂制备了壳聚糖微球，并将其作为噁霉灵微球剂的载体材料。通过CCK-8法[24-25]比较了壳聚糖溶液(CS)、京尼平交联壳聚糖微球(CS-genipin)和戊二醛交联壳聚糖微球(CS-GD)的细胞毒性，结果见图10。24 h培养组中，空白对照细胞存活率为90.87%，CS组为71.11%，CS-genipin组为63.78%，与CS组接近；而CS-GD组细胞存活率仅为17.62%，表明其对细胞的毒性显著高于CS-genipin和CS。48 h培养组中，空白对照细胞存活率为90.88%，与24 h培养组接近；CS组与CS-genipin组与24 h培养相比略有下降，细胞存活率分别为67.67%和61.98%；而CS-GD组随着微球在培养液中降解，释放出更多的戊二醛，进一步增强了细胞毒性，因而细胞存活率仅为11.90%。结果表明，以京尼平为交联剂制备的载体微球的细胞毒性远小于传统交联剂戊二醛。

图 10 壳聚糖、京尼平交联壳聚糖微球和戊二醛交联壳聚糖微球的细胞毒性

a. 24 h细胞毒性试验结果; b. 48 h细胞毒性试验结果。

Figure 10. Cytotoxicity of chitosan, CS-genipin microsphere and CS-GD microsphere

a. Results of the 24 hours cytotoxicity assay. b. Results of the 48 hours cytotoxicity assay.

2.8 噁霉灵微球剂对蚯蚓的急性毒性

市售噁霉灵水剂与所制备京尼平交联壳聚糖噁霉灵微球剂对蚯蚓的急性毒性结果见图11。施药后7 d，空白对照组蚯蚓平均存活率为96.7%；各浓度微球剂和水剂处理组的平均存活率差异较小。施药后14 d，空白对照组蚯蚓平均存活率为93.3%；两种制剂处理组蚯蚓的存活率均随有效成分浓度升高而下降，2000 mg/kg剂量下，噁霉灵微球剂处理组蚯蚓的平均存活率是水剂处理组的1.6倍；3000 mg/kg剂量下，微球剂处理组平均存活率是水剂处理组的2.0倍。研究表明，相比噁霉灵水剂，所制备噁霉灵微球剂在高浓度下仍具有相对较低的蚯蚓急性毒性。通过将有效成分浓度与蚯蚓平均存活率进行线性拟合，推算出噁霉灵水剂的致死中浓度 (LC50) 为2232.88 mg/kg，而噁霉灵微球剂的LC50值为3140.63 mg/kg，微球剂对蚯蚓的安全性提高了约40%。

图 11 噁霉灵微球剂和噁霉灵水剂对蚯蚓的急性毒性

a. 7 d蚯蚓急性毒性试验结果; b. 14 d蚯蚓急性毒性试验结果。

Figure 11. Acute toxicity of hymexazol MS and hymexazol AS to earthworm

a. Results of the 7 days acute toxicity test on earthworms. b. Results of the 14 days acute toxicity test on earthworms.

所制备噁霉灵微球剂对蚯蚓较高的LC50值主要归功于其出色的包封性能和缓释性能，可防止有效成分大量暴露于土壤中，从而显著降低对蚯蚓的急性毒性，表明采用京尼平交联壳聚糖包封噁霉灵制备成微球剂可有效降低其对非靶标生物的毒性。

3 结论

本研究以高生物相容性的天然化合物壳聚糖为载体材料，以绿色低毒的天然产物京尼平为交联剂，通过反向乳液聚合法制备了京尼平交联壳聚糖微球 (CS-genipin)，并分别通过吸附和包封两种载药方式制备了京尼平交联壳聚糖噁霉灵微球。结果表明，包封载药微球的载药率(15.84%)略低于吸附载药微球(18.63%)，但包封载药微球具有更佳的缓释性能，12 h累计释放率为71.56%。两种载药微球具备不同的pH响应缓释性能，且释放过程均符合一级释放动力学模型。包封载药微球相比吸附载药微球和噁霉灵水剂，经土壤处理后有效成分在土壤中的持留时间更长。

根据试验结果，采用包封载药方法制备了京尼平交联壳聚糖噁霉灵微球剂。相同有效成分剂量下，噁霉灵微球剂对瓜果腐霉病菌的杀菌效果与噁霉灵原药相当。盆栽试验证明，在有效成分剂量为9 mg/株时，噁霉灵微球剂比市售噁霉灵水剂对黄瓜苗期猝倒病有更好的防治效果。所制备的京尼平交联壳聚糖微球具有较低的细胞毒性，且以其制备的噁霉灵微球剂对蚯蚓等非靶标生物的急性毒性低于市售噁霉灵水剂。因此，京尼平交联壳聚糖噁霉灵微球剂是一种值得推广的绿色低毒、高效安全、具有缓控释功能的新制剂。