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烟草是全球广泛种植的非食用经济作物。中国烟草的种植面积和总产量均居世界第1位。
安徽是我国重要的烟草产区，烟草的种植对安徽省的农业和经济发展有着极为重要的推动作用，但烟草黑胫病、烟草炭疽病、烟草白粉病等病害发生严重，轻则减产，重则绝收，严重影响烟草品质和产量。
因此，在防治烟草病害方面的问题亟待解决，以促进烟草产业的可持续发展。
虽然化学农药是病害防治高效快速的手段，但其会通过渗透、挥发和迁移等方式渗入土壤水源和大气等自然环境中，对整体生态环境造成威胁，同时也会严重影响农产品生长质量和土壤养分情况。
因此，植物致病菌的生物防治被认为是可持续农业的一项重要措施。
真菌是引起植物病害的常见病原微生物，真菌性病害占植物病害的70%~80%。
真菌病害对作物生长危害严重，降低作物产量，进而造成巨大的经济损失。
土壤微生物群落结构和土壤的功能有密切联系，土壤微生物群落结构反映土壤的生物功能。
植物病原微生物在植株根际定植的数量是其能否侵染植株的关键因素，土传真菌病害的发生与土壤中病原菌数量有良好的相关性。
黏细菌（Myxobacteria）属于δ变形菌纲（Deltaproteobacteria）黏球菌目（Myxococcales），为革兰氏阴性棒状杆菌。
黏细菌Myxococcus sp. BS是本实验室分离出的一株生防菌，室内和田间试验表现出明显的生防效果。
王婷的研究发现当猎物胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum，Pcc）与黏细菌BS共培养时，猎物能诱导黏细菌分泌大量的外膜囊泡。
黏细菌分泌的外膜囊泡聚集在Pcc周围，使Pcc被裂解，由此囊泡在黏细菌捕食Pcc过程中具有一定的作用。
乔燕等通过田间试验发现黏细菌EGB在土传植物真菌病害控制方面具有良好的防控效果，表明其作为一类新型生防微生物，在农业生产过程中的病害控制方面具有重要的应用潜力。
叶现丰发现黏细菌来源的β-1,6-葡聚糖酶（GluM）通过对尖孢镰刀菌细胞壁的水解作用激活了高渗甘油信号（HOG）途径及细胞内活性氧的积累诱导真菌细胞凋亡的产生，造成尖孢镰刀菌孢子和菌丝的死亡。
Dai等的研究表明影响不同堆肥粪便中黏细菌分布的关键非生物因素（pH和Mg2+）与黏细菌群落多样性呈显著正相关，堆肥可增加黏细菌群落多样性并且改良农田土壤。
Wang等研究发现，施用氮肥引起的土壤酸化是土壤黏细菌丰度和细胞密度下降的最重要驱动因素，黏细菌丰度和细胞密度是土壤细菌α和β多样性的潜在驱动因素。
Ye等研究发现，黏细菌EGB通过捕食改变了土壤微生物群落结构，降低土壤中尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum，FOC）的数量，抑制由FOC引起的黄瓜枯萎病。
Wu等研究发现，施肥和秸秆覆盖使小于2 mm土壤组分的细菌Chao1指数下降，并且黏细菌群落结构是土壤微生物多样性最重要的潜在驱动因素。
还有研究表明，微生物菌剂通常会改变土壤微生物群落结构。
因此，在种植烟草时可以添加黏细菌，利用其生防功能，可以将病原菌数量控制在发病阈值内，从而减小经济损失。
本文以安徽省宣城市宣州区的烟稻轮作土壤为研究对象，运用高通量测序技术对黏细菌菌剂和菌肥处理的土壤真菌微生物多样性、群落组成和组装过程进行研究，以期分析黏细菌添加对土壤中真菌群落产生的影响，为黏细菌的生物防治功能和土壤微生物区系调控提供理论指导。
材料与方法
试验材料
菌株
黏细菌Myxococcus sp. BS是南京农业大学生命科学学院分离出的一株生防菌。
分类上属于黏球菌目（Myxococcales）、黏球菌科（Myxococcacceae）、黏球菌属（Myxococcus），由无菌兔粪诱导子实体从土壤中分离获得。
供试烟草
供试烟草为‘云烟97’，由宣城市宣州区烟草产业发展中心提供。
菌剂和菌肥的制备
BS菌剂制备：在10 L发酵罐中添加LBS培养基，按照1%（体积分数）的接种量，将种子液与LBS培养基混合发酵，发酵罐转轴转速100 r·min-1，通气量1500 VVm，30℃、发酵48 h，得到发酵液，BS菌剂制备完成。
BF菌肥制备：将灭菌后的兔粪研磨成粉末，与打碎的稻秸秆以2：1（质量比）混合，湿热灭菌2~3次。
将BS菌剂以1%的接种量接入上述有机肥中，调节温度为30~45℃，含水量为75%，发酵4 d，期间不断翻抛，即得到BF菌肥。
试验设计
试验田位于安徽省宣城市宣州区文昌镇，地理坐标为：118°28' E-119°04' E，30°34' N-31°19' N，采集土壤地的利用方式为多年烟草-水稻轮作。
试验田分为3个试验小区，每个小区面积为86.4 m2（6 m×14.4 m），设置3个处理：CK（不添加任何菌剂或菌肥）、BS（添加菌剂）和BF（添加菌肥）。
每个试验小区有5垄烟草，垄间距为1.2 m，每个小区的种植垄种有烟草32株，株间距0.45 m。
垄垂直方向上，不同处理小区间用1垄烟草苗作为隔离行。垄平行方向上，不同处理小区间由5株烟草苗隔开。隔离区的烟草苗株距和移栽的烟草苗与处理小区相同。
烟草田间试验时间是2019年5月25日，CK试验区不施用菌剂或菌肥，作对照处理；在BS试验区的每棵烟草植株根际施加5 mL BS菌剂；在BF菌肥试验区的每棵烟草植株根部穴施加10 g发酵后的BS固态菌肥。
土壤样品的采集
在每个试验小区设置3个采样点，每个采样点使用五点取样法采集土壤样品。
土壤采样器事先经消毒处理，将表层土刮去后用土壤取样器取烟草植株根际处0~20 cm的土壤，去除土壤中石砾和植物残根，完成单次采样。
按上述操作完成余下采样，共采集9个样品。
将采集的土壤装入自封袋后，冷藏运输至实验室，放入-80℃冰箱保存，用于后续土壤总DNA的提取。
土壤DNA的提取和Illumina高通量测序
土壤样品微生物DNA的提取参见试剂盒FastDNATM Spin Kit For Soil（MP Biomedicals，USA）的说明书，每个处理3个DNA重复样品。
将各个处理对应的DNA，送至天津诺禾致源生物科技公司进行高通量测序分析。
使用Ion S5TM XL测序平台，利用单端测序（Single-End）的方法，构建小片段文库进行单端测序，对各个样品的土壤总DNA中ITS序列进行测序。
引物为ITS1-1F-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS1-1F-R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’），对真菌ITS1可变区进行PCR扩增。
PCR扩增体系（30 μL）为：Phusion Master Mix（2×）15 µL，Primer F（1 mol·L-1）1 µL，Primer R（1 mol·L-1）1 µL，gDNA（1 ng·µL-1）10 µL，ddH2O补足30 µL；PCR扩增程序为：98℃，1 min；30个循环包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。
2 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用GeneJET胶回收试剂盒（Thermo Fisher Scientific，USA）回收纯化产物，之后使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒（Thermo Fisher Scientific，USA）构建文库，文库经Qubit定量和文库检测合格后采用Ion S5TM XL平台进行上机测序。
使用Cutadapt减去测序结果中的低质量序列，以97%相似度聚类为操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU），然后利用UNITE数据库对OTUs序列进行物种注释。
测序分析与数据处理
使用Chao1指数和Shannon指数表征不同样品的细菌群落α多样性，并使用R包“vegan”计算观察到的OTU。
丰度差异散点图用于显示不同OTU丰度变化的差异性。
本研究选择错误发现率（FDR）来调整P值。
使用R包“DESeq2”计算log2倍数变化（log2FC）和调整后的P值。
OTU的差异丰度图是使用R包“ggplot2”构建的。
使用OriginPro2021（ver.9.80）中的“主坐标分析”应用程序构建PCoA图。
在HutlabGalaxy网站（
https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）应用程序1上进行线性判别分析（LDA），同时结合效应大小（LEfSe）测量，以找到各处理之间的统计生物标志物。
真菌亚群落的组装过程是使用“MicEco”包中的“ses.comdistnt”函数构建的，使用beta平均最近分类单元距离（βMNTD）来确定在群落的系统发育结构。
同时，通过空模型分析评估真菌亚群落的随机和确定性生态过程。
使用R包“iCAMP”定量分析真菌的群落组装过程，确定随机过程的扩散限制和非主导过程的比例，以及确定性过程的变量选择和同质选择的比例。
结合beta最近分类单元指数（βNTI）和通过模拟得到的Bray-Curtis距离小于实际观察到的Bray-Curtis距离的比例（RCbray）来确定不同生态过程对真菌群落组装过程的贡献度，其中，βNTI值 > 2为变量选择的影响，βNTI值 < -2为同质选择的影响，|βNTI| < 2且RCbray > 0.95为扩散限制的影响，|βNTI| < 2和RCbray < 0.95则用于估计非主导过程的影响。
添加黏细菌对土壤真菌多样性的影响
α多样性
从9个样品测序结果中共得到575 867条有效序列，将序列按照97%相似水平聚类，共得到1 395个真菌OTU。
通过Chao1指数分析可以发现，添加菌剂和菌肥后，土壤中的真菌丰富度呈现显著下降的趋势，并且添加菌肥的土壤中真菌丰富度比添加菌剂的土壤中真菌丰富度下降更多。
Shannon指数结果表明，添加菌剂和菌肥后，BS和BF处理组中的Shannon指数增加，说明群落多样性增加。
《烟草栽培学》
《不同生态烤烟化学成分的变化及其相关气候因素研究》
《安徽烟草的起源与发展》
