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苜蓿MYB样转录因子MsMYBH正调控苜蓿幼苗抗旱性并经历MsWAV3介导的降解

花匠小妙招
2024-11-19 03:16

题目：An alfalfa MYB-like transcriptional factor MsMYBH positively regulates alfalfa seedling drought resistance and undergoes MsWAV3-mediated degradation

刊名：Plant Physiology

作者：Kun Shi, Zan Wang et al.

单位：China Agricultural University, Beijing

日期：14 February 2024

摘要

干旱是苜蓿生产的主要威胁。发现调控干旱反应的重要苜蓿基因将有助于抗旱苜蓿品种的选育。在此，我们报道了苜蓿抗旱性的全基因组关联研究。我们鉴定了一种MYB样转录因子基因（MsMYBH），并对其进行了功能鉴定，该基因可提高苜蓿的抗旱性。与野生型相比，MsMYBH过表达植物的生物量和饲料质量都有所提高。结合RNA-seq、蛋白质组学和染色质免疫沉淀分析表明，MsMYBH可以直接与MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB的启动子结合，以提高其表达。这种相互作用的结果包括更好的水分平衡、高的光合效率和清除过量的H2O2以应对干旱。此外，发现E3泛素连接酶（MsWAV3）通过26S蛋白酶体途径在长期干旱下诱导MsMYBH降解。此外，在一组种质中对MsMYBH启动子中的可变数量串联重复序列进行了表征，并且这种变异与启动子活性有关。总之，我们的发现揭示了MsMYBH的功能，并提供了一个可用于培育抗旱苜蓿的关键基因。这一发现也为苜蓿抗旱机制提供了新的见解。

技术路线

Phenotyping drought-related traits

SNP calling and genome-wide association analysis

Construction of transgenic alfalfa plants and phenotypic analyses

Transcriptome and proteome analysis

Identification of target gene directly regulated by MsMYBH

Interaction between MsMYBH and MsWAV3

Promoter-LUC assays in tobacco leaves

主要结果

3.1 苜蓿苗期抗旱性的GWAS分析

如前所述，我们对109份苜蓿材料进行了9个干旱相关性状的表型分析，包括株高（PH）、地上生物量（AB）和7个叶绿素荧光参数。在这里，我们使用每个性状的抗旱系数（DRC）来进行与基因型数据的关联研究。

21个SNPs被鉴定为P < 3.975×10−6，其中4个SNPs与AB、12个与Fm、2个与Fo、1个与Fs和2个与NPQt相关（图1A）。12个Fm SNPs来源于12个单独的基因，分布在7条染色体上。一个SNP（MTR_42730294）解释了28.3%的Fm变异，位于8号染色体上的基因（Medtr8g101650.1）（图1A）。

我们使用两个对照组（抗旱和抗旱敏感）的材料进行了基因表达研究。我们发现，在干旱胁迫下，该基因在抗旱基因型（ZW1231和ZW0430）中显著上调，在干旱敏感基因型（ZW1304和ZW0728）中下调（图1B）。300℃下苜蓿“中苜1号”的观察 mM甘露醇处理后，该基因在叶片和根中的表达被显著诱导（图1C）。这些结果表明，该基因（Medtr8g101650.1）在对干旱胁迫的反应中具有转录活性。

图1 Fm的GWAS曼哈顿图和候选基因Medtr8g101650.1对干旱的响应（A）曼哈顿图表示与Fm相关的显著SNPs。（B） Medtr8g101650.1在两个抗旱（ZW1231和ZW0430）和两个抗旱敏感（ZW1304和ZW0728）材料中的表达（C） Medtr8g101650.1在300℃以下“中苜1号”组织中的表达 mM甘露醇处理。

3.2 MsMYBH被证实为MYB样转录因子

我们将Medtr8g101650.1注释为MYB样转录因子，并将其命名为“MsMYBH”。通过系统发育分析，我们发现它具有MYB样DNA结合域（SHAQKYF），并且与AtMYBH具有高蛋白序列同源性（图2A）。然后，我们从苜蓿“中苜1号”中克隆了该基因，并对其功能进行了实验表征。我们观察到MsMYBH主要在叶和根中表达（图2B）。亚细胞定位分析显示，其蛋白质仅定位在细胞核中（图2C）。MsMYBH在酵母系统中的转录激活活性测定显示没有转录激活（图2D）。

图2：MsMYBH的系统发育分析、组织表达模式、亚细胞定位和转录活性

（A）利用MEGA6、近邻连接法对MsMYBH及其同源物进行系统发育分析。

（B） MsMYBH在苜蓿不同组织中的表达模式。

（C） MsMYBH蛋白的细胞核定位。

（D） MsMYBH在酵母细胞中的转录激活。

3.3 MsMYBH提高苜蓿的生物量和抗旱性

为了确定MsMYBH在干旱中的功能，我们产生了含有35S:MsMSMYBH的转基因植物，以及通过RNA干扰（RNAi）敲低MsMYBH的转基因植物。

为了模拟干旱胁迫，我们对野生型（WT）、过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）系的幼苗进行了为期2周的缺水处理，然后再进行复水处理。

对这些品系的评估表明，OE品系比WT更具抗性（图3A）；相反，RNAi系在压力下是最敏感的（图3A）。

在水分损失测定中，与WT品系相比，RNAi品系表现出更高的水分损失，而OE品系损失的水分更少（图3B）。用远红色相机测量的叶片温度可以反映蒸腾水平，较高的温度表明蒸腾作用较低。OE线显示出比WT更高的温度，而RNAi线显示出更低的温度（图3C），表明OE比WT或RNAi蒸发的水更少。

我们比较了植物生长1个月后的抗旱性；结果还表明，MsMYBH的过表达显著增强了胁迫耐受性，MsMYBH的低表达使植物更易感（图3D）。

图3 干旱条件下MsMYBH过表达（OE）和敲除（RNAi）系的表型特征

（A） OE系（1，2，3）、RNAi系（1、2、3）和WT植物在正常的充分浇水和干旱条件下在盆中生长1个月的生长性能。

（B） WT、OE和RNAi系中的分离叶片水分损失测定。

（C）通过红外热成像测定法测量的OE和RNAi系与WT的叶片温度的比较。

（D）在正常的充分浇水（CK）和干旱条件下，转移到盆中40天后生长的WT、OE系和RNAi系的植物表型。

此外，我们还观察了对照和干旱处理下所有植物在生长和生理上的差异。所有植物的高度没有差异（图4A）。在对照和干旱条件下，OE品系比WT具有更多的分枝，而RNAi品系具有更少的分枝（图4B）。干旱处理后，OE系的相对含水量（RWC）和脯氨酸（Pro）最高，但丙二醛（MDA）含量最低，RNAi系的趋势相反（图4C–E）。这些结果证实了MsMYBH增强苜蓿抗旱性的能力。

图4 MsMYBH过表达（OE）和敲低（RNAi）系与野生型在正常（CK）和干旱（干旱）条件下的生长和生理差异

（A）对照和干旱条件下OE、RNAi系和WT植物的株高。

（B）对照和干旱条件下OE系、RNAi系和WT的分支数量。

（C–E）对照和干旱条件下OE、RNAi系和WT的生化测量，包括叶片的相对含水量（C）、丙二醛含量（D）和脯氨酸含量（E）。

（F） DAB染色用于可视化ROS的积累。

（G–I）ROS清除酶的活性，包括POD（G）、CAT（H）和SOD（I）。

为了评估MsMYBH对抗旱性的影响是否与ROS有关，我们用3，3-二氨基联苯胺（DAB）对干旱胁迫植物的叶片进行染色，以指示过氧化氢（H2O2）的含量。与野生型植物相比，DAB染色在RNAi系中增强，在OE系中减少（图4F）。在干旱处理下，OE系的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和SOD活性也高于WT植物（图4G–I）。即使在对照条件下，OE品系的POD活性也显著高于WT植物（图4G）。这表明MsMYBH介导的抗旱性确实通过清除H2O2来减少氧化应激。

此外，在GWAS中，Fm与MsMYBH相关，我们在这里研究了WT、OE和RNAi系中的Fm和叶片光合速率（Pn）。结果显示，在CK和干旱条件下，OE中的Pn和Fm显著高于WT和RNAi系（图5A，B），表明MsMYBH过表达促进了光合作用。

为了研究如此高的光合作用速率是否会导致OE系的高产，我们测量了生物量，包括CK条件下的鲜叶重、干叶重和茎叶比。鲜重和干重均显著高于对照组（P < 0.05）（图5C，D），但OE系的茎叶比较低（图5E）。RNAi-1和RNAi-3植物的鲜重和干重低于野生型植物，但RNAi-2植物与野生型植物没有显著差异（图5C，D）；RNAi系和WT之间的茎叶生物量比没有显著差异（图5E）。关于质量性状，OE、RNAi和WT植物的粗蛋白含量没有差异（图5F）；OE株系的中性纤维（NDF）（图5G）和酸性纤维（ADF）含量显著低于WT株系（图5H）。总体而言，这些数据表明，MsMYBH表达的增加提高了光合效率和防御水平，以在干旱条件下维持营养生长。

图5 OE、RNAi系和WT的光合能力、生物量和质量特征

（A，B）CK和干旱条件下的叶片光合速率（Pn）和Fm。

（C–H）对照条件下OE、RNAi和WT的生物量（C，D）和质量（E–H）。

3.4 MsMYBH是MsMCP1、MsPRX1A和MsCARCAB1的转录调节因子

在正常条件下对MsMYBH OE系和WT植物的转录组学分析显示，2090个上调基因和4305个下调基因，这两个基因的表达水平显著（P < 0.05）在两个OE系和WT之间表达。

上调的基因富集在环境信息处理类别中的植物激素信号通路、ABC转运蛋白和磷酸肌醇信号传导中。这些上调的基因包括硝酸盐转运蛋白/肽转运蛋白（NRT1/PTR）家族基因、钾转运蛋白1（POT1）、磷酸盐转运蛋白PHO1样蛋白（PHO1类）和磷酸盐转运蛋白1-4（PHT1-4）。转录组学表明，营养物质的输送和分布发生了变化，这可能与OE系中生物量的增加有关。

为了鉴定MsMYBH直接调控的下游基因，我们对OE-1和WT植物进行了RNA-seq和蛋白质组学联合分析。共有12322个差异转录本（P < 0.05）和408种差异蛋白（P < 0.05）。转录组学和蛋白质组学分析显示有86个重要基因（图6A），其中22个上调基因（对应于12种蛋白质）的结合位点如下所示。

我们使用PlantCARE在22个基因的启动子中筛选潜在的MYB结合位点（MBS）。设计了跨越MBS区域的引物。MsMYBH的结合活性通过染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）测定进行。我们发现MsMYBH可以与八个基因的启动子结合，这些基因包括两个液泡膜固有水通道蛋白基因（MsMCP1、MsMCP2）、一个过氧化物酶基因（MsPRX1A）、叶绿素a–b结合蛋白基因（MsCARCAB1）、一种螺旋蛋白（MsPO22）、热休克蛋白基因（MsHSP18.1）、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白10基因（MsPGIP10）和一个b样细胞周期蛋白基因（MscycMs3）（图6B）使用MEME，我们分析了它们的启动子序列中可能的保守基序，发现一个基序（CAACTG）显著富集（图6C）。已知该基序是参与拟南芥干旱诱导的MBS。

我们进行了电泳迁移率偏移测定（EMSA），并证实MsMYBH可以与苜蓿中四个基因的MBS基序结合，包括MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB（图6D）。这些基因的表达在OE系中增加，在RNAi系中减少（图6E）。相对萤光素酶（LUC）活性测定显示，效应基因MsMYBH的表达显著增加了四个基因的启动子（图6F）。所有证据表明MsMYBH与四个苜蓿基因的启动子结合以促进其表达。

图6 MsMYBH直接调节苜蓿中MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB的表达（A）使用OE系在转录组和蛋白质组中总共发现86个差异表达基因。（B） MsMYBH在下游基因启动子中富集的ChIP-qPCR分析（C）在使用MEME套件的ChIP-qPCR测定中鉴定的候选基因的上游启动子序列中，基序CAACTG显著富集。（D）显示MsMYBH与MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB的启动子直接结合的EMSA。（E） MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB在WT、OE和RNAi系中的相对表达。（F）当与MsMYBH-62SK（效应载体）共转化时，MsMCP1、MsMCP2、MsPRX1A和MsCARCAB启动子（报告载体）的pGreenII 0800-LUC构建体的相对LUC/REN活性。

3.5 MsWAV3与MsMYBH相互作用并介导其在体内的降解

双杂交分析显示，MsMYBH与几种蛋白质相互作用，包括泛素E3连接酶（MsWAV3）（图7A）。MsWAV3与AtWAV3同源，AtWAV3是一种环指E3泛素连接酶，作为PIN极性和根向重性的重要决定因素。MsMYBH和MsWAV3之间的相互作用通过双分子荧光互补（BiFC）分析得到验证。

将这两种蛋白质分别融合到增强型YFP（黄色荧光蛋白）的N-末端（nYFP）或C-末端（cYFP）上。当MsMYBH YFPC与MsWAV3 YFPN共表达时，我们在烟草表皮细胞中观察到重组的荧光信号。YFPC和MsWAV3 YFPN组合的共表达未能产生YFP信号（图7B）。

此外，在MYC-MsMYBH和GFP-MsWAV3都共表达的烟叶中进行了共免疫沉淀（co-IP）测定。当使用抗MYC的抗体从叶片的蛋白质提取物中沉淀MYC-MsMYBH时，通过抗GFP抗体检测到GFP-MsWAV3融合蛋白（图7C）。当MYC-MsMYBH和GFP共表达时，抗GFP抗体未检测到GFP蛋白（图7C）。因此，MsMYBH和MsWAV3的蛋白质-蛋白质相互作用得到了证实。

下一个问题是MsMYBH是否是MsWAV3的泛素化靶点。使用抗泛素抗体，我们发现脱水4小时后，OE-1叶片中总蛋白的泛素化增加（图7D）；MsMYBH在脱水的**个小时内积累，但在脱水2小时后减少 h（图7E），表明泛素化在干旱时被激活。

然后，我们研究了MsWAV3是否介导MsMYBH的降解。我们使用在大肠杆菌中产生的重组GST标记的MsMYBH和麦芽糖结合蛋白（MBP）标记的MsWAV3进行了体外泛素化测定。我们的体外实验表明，在重组E1（His-UBA1）、E2（UbcH5b）和FLAG标记的泛素（FLAG-UBQ）存在的情况下，GST MsMYBH经历了由MBP-MsWAV3驱动的多泛素化。值得注意的是，如使用抗GST、抗MBP和抗Ubi抗体的蛋白质印迹分析所证实的，省略任何这些必需成分都会消除GST MsMYBH的泛素化（图7F）。

用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理，增加了OE-1叶片中免疫沉淀的MsMYBH蛋白的泛素化水平，表明其在体内被26S蛋白酶体降解（图7G）。MsWAV3基因表达水平在脱水的**个小时降低，但在2–8小时后增加（图7H）。

此外，我们使用瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默来操纵MsWAV3基因的表达，以了解它如何影响MsMYBH。因此，我们发现MsWAV3在OE-1叶片中的上调或下调都不会改变MsMYBH的表达（图7I）。然而，与野生型植物相比，MsWAV3过表达的叶片中的MsMYBH蛋白水平显著较低（图7I），并且在MG132处理后其水平增加（图7I）。

当MsWAV3被RNAi（EV RNAi）敲低时，叶片中的MsMYBH蛋白水平更高（图7I）。与使用空载体的对照植物相比，使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）抑制苜蓿幼苗中MsWAV3的表达增强了其抗旱性。我们的结果有力地表明MsMYBH是MsWAV3的泛素化靶标，其水平由泛素26S蛋白酶体降解途径介导。

图7 MsWAV3通过泛素-26S蛋白酶体降解介导MsMYBH降解

（A） MsMYBH–MsWAV3相互作用的酵母双杂交分析

（B） BiFC分析揭示MsMYBH–MsWAV3相互作用。

（C） MsMYBH与MsWAV3在Co-IP实验中相互作用。

（D）使用抗泛素抗体通过蛋白质印迹检测进行性脱水WT叶片中的总蛋白的泛素化。

（E）通过使用抗MsMYBH抗体的蛋白质印迹法测定MsMYBH蛋白在逐渐脱水的OE-1系的叶片中的表达。

（F） MsMYBH在体外的MsWAV3泛素化。

（G） MG132处理提高了MsMYBH的泛素水平。

（H） MsWAV3在逐渐脱水的OE-1叶片中的表达。

（I） MsWAV3的过表达增加MsMYBH蛋白的降解，MG132抑制MsMYBH的降解。敲低MsWAV3提高MsMYBH水平。

3.6 MsMYBH启动子序列变异与抗旱性相关

VNTR变异是植物基因组的共同特征之一。在这里，我们研究了耐旱和耐旱苜蓿基因型之间MsMYBH启动子区的VNTR（图8A）。DNA序列分析显示，串联重复序列（CCCA）存在于MsMYBH起始密码子（ATG）的上游区域，CCCA拷贝数因基因型而异（图8B）。

参考基因组中有四个串联CCCA拷贝（VNTR-4）。在这里，我们观察到更多的串联拷贝（四至六个）出现在抗旱基因型中，但在干旱敏感基因型中只有两个和四个拷贝（图8B）。

为了研究这种VNTR变异的功能，我们克隆了含有两个、四个、五个和六个串联CCCA拷贝的启动子（图8B），并在烟叶中进行启动子LUC瞬时表达测定，以监测具有不同拷贝数的启动子的转录活性，即VNTR-2、VNTR-4、VNTR-5和VNTR-6（图8C-E）。VNTR-5和VNTR-6型启动子的转录活性显著高于VNTR-2和VNTR-4型启动子（图8D，E）。结果表明，MsMYBH启动子中的VNTR不仅与干旱相关基因型相关，而且VNTR的拷贝数越高，转录活性越高。