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长期化肥有机替代对黑土氮转化相关酶活性的影响

花匠小妙招
2024-11-19 18:23

【研究意义】黑土作为我国重要的粮食产区，耕地利用强度高，化肥投入量大，而氮素作为作物生长的必需和主要限制性元素之一[1-2]，更是大量的投入到农业生产当中。长期单一的化肥氮素投入方式导致氮肥利用率低，使氮素大量损失，造成经济损失的同时还引起了诸如黑土土壤酸化、板结、肥力下降等负面效应[3-4]。为了提高肥料利用效率，降低由于氮肥施入产生的负面效应与隐患，有机含氮物料部分替代化肥氮素成为主要研究方向之一。氮素进入土壤后的转化是在土壤氮转化相关酶的作用下完成的[5]。有机氮的矿化、尿素的水解、硝化及反硝化是氮素在土壤中转化的主要过程。其中多酚氧化酶在有机氮转化和水解过程中发挥重要作用[6-7]，而过氧化氢酶可以防止土壤中过氧化氢对土壤氮转化微生物的毒害作用，并且催化过氧化氢氧化土壤中酚类和胺类化合物，影响氮转化过程[7]。脲酶是土壤中唯一可以迅速分解尿素的酶，研究发现，在土壤脲酶灭活条件下，尿素的半解期长达3.6年，而在脲酶活性恢复后，尿素分解速度提高了1014倍[8]。有机氮矿化和尿素水解的最终产物均为铵态氮（NH4 + ），NH4 + 在氨单加氧酶（AMO），羟胺氧化还原酶（HAO），硝酸氧化酶的逐级作用下，转化成为硝态氮（NO3−），该过程即为硝化作用。NO3−在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下可以还原成为N2O、NO、N2等[9]，即反硝化过程。由此可以看出土壤氮转化相关酶活性在氮素的循环，养分供给，生态环境效应中均充当重要角色。研究有机物料部分替代化肥对氮转化相关酶活性的影响、生态文明建设战略中具有重要意义。【前人研究进展】李明松等人[10]研究发现，与单独施用化肥相比有机粪肥与化肥配施在玉米生长期内有效提高了25% ~ 40%的土壤过氧化氢酶活性，降低了9.7% ~ 23.5%的多酚氧化酶活性。Ni等[11]研究发现，秸秆还田有效提高了58.6%的脲酶活性和27.5%的过氧化氢酶活性。逄娜[12]研究指出，施用畜禽粪便显著提高了12.1% ~ 16%的土壤脲酶活性。【本研究切入点】虽然针对东北黑土区有机物料部分替代化肥对土壤酶活性影响已有诸多研究，但是相关研究所选取的有机物料相对单一，缺乏不同有机物料间的对比研究。并且试验模式大多以室内培养和短期田间试验形式开展，缺乏长期定位条件下对土壤酶活性的研究。另外，针对有机物料部分替代化肥处理对多酚氧化酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶等氮转化相关酶的研究也不够完善。【拟解决的问题】本研究以“国家黑土土壤肥力与肥料效益长期定位监测基地”为研究平台，研究长期化肥有机替代（畜禽粪肥和秸秆）对土壤脲酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、硝化还原酶和亚硝酸还原酶的影响（AMO及HAO活性目前测定方法不明，因此本文不做研究），在土壤酶活性方面为生态文明建设和黑土地保护战略的实施提供基础数据和理论支撑。

1. 材料与方法

1.1 试验地概况

国家黑土土壤肥力与肥料效益长期定位监测基地位于吉林省公主岭市吉林省农业科学院（124°48′ E, 43°30′ N）。气候类型为温带大陆性季风气候，年均温5.5 ℃，年降水量450 ~ 650 mm，年日照时数2500 ~ 2700小时，降水主要集中于6、7、8月份，无霜期110 ~ 140 d。试验始于1989年（1989年整地施肥）。

1.2 试验设计

本研究选择长期定位试验的4个处理进行分析：①不施肥处理（CK）；②单施化肥处理（NPK）；③有机肥部分替代化肥处理（NPKM）；④秸秆部分替代化肥处理（NPKS）。试验布设于1989年（1989年整地设置试验，1990年第一次采样）。肥料投入为等氮量投入。种植作物为玉米，种植密度为6万株 hm–2。每个处理试验区面积为400 m2，未设置重复试验区，因此，在进行土壤样品取样时，在试验区内随机设置三个取样点，采样点确定后每个取样时间点均在同一位置进行土壤样品采集，采样深度为0 ~ 20 cm，取样时间分别为播种前（2022年4月25日，26日播种）、苗期（5月15日）、拔节期（追肥前）（6月25日）、拔节期（追肥后）（7月1日）、开花期（7月20日）、灌浆期（8月13日）、成熟期（9月28日）。截至2022年，长期定位试验已开展32年，2006年有机粪肥由猪粪改为牛粪，除此之外，其他每年施用肥料数量、种类、施用方法及田间管理措施相同。肥料氮肥种类为尿素，磷肥种类为过磷酸钙，钾肥为硫酸钾，有机肥为牛粪，秸秆为试验区玉米秸秆。各处理中磷肥与钾肥以底肥形式一次性施入，氮肥则以总量的1/3作为底肥，2/3于拔节期追施。有机粪肥于每年玉米收获后以旋耕方式与土壤混合，秸秆添加处理是首先将秸秆从田间移除，自然风干后人工粉碎，于第二年追肥后施于垄沟，作物收获后以旋耕方式与土壤混合。每年收获后各处理地上留茬15 cm，与根茬共同还田。各处理土壤基础理化性质及施肥量如见表1、2所示。

表 1 化肥有机替代对0 ~ 20cm土壤理化性质的影响（2022年）

Table 1. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil physic-chemical properties （2022）

处理
TreatmentpH土壤有机碳
Soil organic
carbon
（g kg−1）全氮
Total
nitrogen
（g kg−1）全磷
Total
phosphorus
（g kg−1）全钾
Total
potassium
（g kg−1）容重
Bulk
density
（g cm−3）碱解氮
Available
nitrogen
（mg kg−1）有效磷
Available
phosphorus
（mg kg−1）速效钾
Available
potassium
（mg kg−1） CK 7.72 ab 14.5 d 1.28 b 0.59 c 24.54 c 1.29 b 113.6 c 2.4 d 130.3 d NPK 5.97 c 16.95 c 1.35 b 0.76 b 21.21 d 1.40 a 118.3 c 51.5 b 203.0 b NPKS 7.99 a 18.26 b 1.60 b 0.78 b 26.51 b 1.25 c 122.9 b 169.8 a 180.0 b NPKM 7.26 b 26.90 a 2.33 a 1.19 a 27.06 a 1.19 d 160.8 a 34.8 c 229.0 a 　　注：不同小写字母表示不同处理在95%水平上差异显著（P < 0.05）。

表 2 不同处理每年肥料施用量

Table 2. Treatments and fertilizer amounts

试验处理
Treatment化肥用量（kg hm−2）
Chemical fertilizer有机物料（kg hm−2）
Organic material 秸秆
Stalk有机肥（牛粪）
Manure（Cattle） NP2O5K2ONN CK − − − − − NPK 165 82.5 82.5 − − NPKS 112 82.5 82.5 53 NPKM 49.5 82.5 82.5 − 115.5 1.3 分析与检测方法

土壤pH利用pH测定仪（土水比为1∶2.5）进行测定；土壤脲酶活性采用扩散法进行测定，以1 g土壤中NH3-N的含量表征；土壤过氧化氢酶采用容量法进行测定，以1 g土壤消耗0.1N高锰酸钾的体积数（ml）表征；土壤多酚氧化酶采用紫色没食子酸比色法进行测定，以1 g土壤中紫色没食子素含量表征；硝酸还原酶和亚硝酸还原酶通过测定土壤中被还原的NO3−-N和NO2−-N量进行测定[9]。

1.4 数据计算与统计分析

数据采集及处理工作利用Excel 2013完成；利用SPSS 21软件进行95%水平上的数据差异显著性分析；利用Origin 9.0绘制图表。

2. 结果与分析

2.1 化肥有机替代对玉米生育期内土壤脲酶活性影响

纵观不同处理下玉米生育期内土壤脲酶活性的变化趋势，脲酶活性的平均值的整体趋势为NPKM（2.0 mg g–1 h–1）> NPKS（1.89 mg g–1 h–1）> NPK（1.55 mg g–1 h–1）> CK（1.39 mg g–1 h–1）（图1）。与NPK相比，NPKM和NPKS平均分别提高29%和21.9%的脲酶活性。

图 1 化肥有机替代对玉米生育期内土壤脲酶活性的影响

Figure 1. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil urease activities during maize growth period

在播种前、苗期和拔节期（追肥前），NPKS与NPKM处理中脲酶活性显著高于NPK处理（P < 0.05），而其他时期差异不显著（P > 0.05）。播种前期，NPKS与NPKM处理的脲酶活性与NPK处理相比分别提高了93.5%和68%；苗期分别提高21.5%和23.3%；拔节期（追肥前）分别提高30.1%和34.9%（P < 0.05）（图1）。

不同处理的土壤脲酶活性在玉米生育期内整体呈现出先升高后下降的变化趋势（图1）。其中，苗期到拔节期（追肥前），NPK、NPKS、NPKM处理土壤脲酶活性呈短暂下降趋势，追肥结束后快速升高。NPK、NPKS、NPKM处理土壤脲酶活性最高值均出现在拔节期（追肥后），分别为2.17、2.24和2.5 mg g–1 h–1。

2.2 化肥有机替代对玉米生育期内土壤多酚氧化酶的影响

不同处理下土壤多酚氧化酶在玉米生育期内呈先升高后下降的变化趋势，NPKS处理玉米生育期内土壤多酚氧化酶平均值的整体高于其他处理，其中，在拔节期（追肥后）和开花期达到显著差异水平（P < 0.05）（图2）。拔节期（追肥后），NPKS处理土壤多酚氧化酶活性与NPKM和NPK处理相比分别提高37.1%和15.7%；开花期分别提高20.8%和29.8%（P < 0.05）。

图 2 化肥有机替代对玉米生育期内土壤多酚氧化酶活性的影响

Figure 2. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil polythenol oxidase activities during maize growth period

NPKM与NPK处理，土壤多酚氧化酶活性在玉米生育期内呈交替变化趋势（图2）。但在苗期、拔节期（追肥后）及灌浆期，NPK处理中土壤多酚氧化酶活性均高于NPKM处理且差异达到显著水平（P < 0.05），而NPKM处理土壤多酚氧化酶活性仅在开花期和成熟期高于NPK处理，但差异未达到显著水平（P > 0.05）。不同处理间多酚氧化酶活性的平均值的整体趋势为NPKS（141.8μg g–1 2h–1） > NPK（122.4μg g–1 2h–1） > NPKM（111μg g–1 2h–1） > CK（102.4μg g–1 2h–1），与NPK相比，NPKS处理土壤的多酚氧化酶活性提高了15.9%，而NPKM处理降低了9.3%。

2.3 化肥有机替代对玉米生育期内土壤过氧化氢酶活性的影响

施肥（NPKS、NPKM、NPK处理）提高了玉米生育期内土壤过氧化氢酶活性（图3）。在玉米全生育期内，不同处理土壤过氧化氢酶活性平均值表现为NPKM（17.55 ml g–1）> NPKS（17.46 ml g–1）> NPK（17.09 ml g–1）> CK（16.4 ml g–1），与NPK相比，NPKM和NPKS平均分别提高2.7%和2.2%。但在成熟期，NPKS处理土壤过氧化氢酶活性超越NPKM处理，表现为NPKS > NPKM > NPK > CK。不同处理土壤过氧化酶活性在玉米生育期内均表现出先升高后下降的变化趋势。

图 3 化肥有机替代对玉米生育期内土壤过氧化氢酶活性的影响

Figure 3. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil catalase activities during maize growth period

在苗期和成熟期，不同施肥处理（NPKS、NPKM、NPK）土壤过氧化氢酶活性之间差异达到显著水平（P < 0.05）。苗期，NPKS与NPKM处理的过氧化氢酶活性与NPK处理相比分别提高了2.9%和4.6%（P < 0.05）；成熟期分别提高了4.3%和2.4%（P < 0.05）。

2.4 化肥有机替代对玉米生育期内土壤硝酸还原酶活性变化的影响

在玉米生育期内，不同施肥处理土壤硝酸还原酶活性差异显著，其平均值表现趋势为NPKM（1.16 mg kg–1 24h–1） > NPKS（1.03 mg kg–1 24h–1） > NPK（0.83 mg kg–1 24h–1） > CK（0.7 mg kg–1 24h–1）（图4）；与NPK相比，NPKM和NPKS处理的硝酸还原酶活性平均分别提高39.8%和24.1%。在播种前和拔节期（追肥后），与NPK相比，施用有机物料处理NPKM、NPKS土壤硝酸还原酶活性显著提高（P < 0.05）。播种前期，NPKM与NPKS处理硝酸还原酶活性与NPK处理相比分别提高43.2%和31.9%；拔节期（追肥后）分别提高52.6%和31.3%。

图 4 化肥有机替代对玉米生育期内土壤硝酸还原酶活性的影响

Figure 4. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil nitratase activities during maize growth period

NPKM与NPKS处理土壤硝酸还原酶活性最高值出现在拔节期（追肥后），分别为 1.6 mg kg–1 24h–1和1.4 mg kg–1 24h–1，随后呈现逐渐降低趋势。

2.5 化肥有机替代对玉米生育期内土壤亚硝酸还原酶活性的影响

玉米生育期内有机物料部分替代化肥处理（NPKM和NPKS）土壤亚硝酸酶活性高于其它处理（图5），具体表现为NPKM（7.35 mg kg–1 24h–1） > NPKS（7.19 mg kg–1 24h–1） > NPK（6.78 mg kg–1 24h–1） > CK（6.71 mg kg–1 24h–1）（图5）。与NPK相比，NPKM和NPKS处理的硝酸还原酶活性平均分别提高8.4%和6.1%。在播种前期、苗期、拔节期（追肥前）、拔节期（追肥后），NPKM与NPKS土壤亚硝酸还原酶活性显著提高（P < 0.05）。播种前期，NPKM与NPKS处理硝酸还原酶活性与NPK处理相比分别提高10.4%和6.5%；苗期分别提高10.2%和11%；拔节期（追肥前）分别提高6.5%和9.8%；拔节期（追肥后）分别提高6.7%和14.1%。各处理土壤亚硝酸还原酶活性在玉米生育期内整体呈现出逐渐上升趋势（图5）。

图 5 化肥有机替代对玉米生育期内土壤亚硝酸还原酶活性的影响

Figure 5. Effects of organic substitution of chemical fertilizer on soil nitrite reductase activities during maize growth period

3. 讨论

土壤酶主要来源于土壤微生物、动物的分泌以及动植物残体的分解[13]。本研究中，有机物料部分替代化肥等氮量施入，单施化肥处理（NPK）的尿素用量明显高于添加有机物料处理（NPKM、NPKS），从底物含量来分析，脲酶反应底物高的NPK处理土壤脲酶活性应高于NPKM和NPKS处理。但是，本研究中，NPKM与NPKS处理玉米生育期内土壤脲酶活性高于NPK处理（图1），主要原因是长期有机物料投入提高了土壤中有机质的含量（表1），进而提高了土壤的微生物量，促进了脲酶的分泌[14-15]，另外有机质中的腐殖物质对脲酶也发挥稳定和促进活性的作用[16-17]。

多酚氧化酶参与土壤有机组分中芳香族化合物的转化过程，能把土壤中芳香族化合物氧化成醌，醌与土壤中蛋白质、氨基酸、糖类、矿物等物质反应生成不同分子量的有机质和色素，进而完成土壤有机芳香族化合物的循环[6]。本研究中，与NPK处理相比，不同有机物料的施用在玉米生育期内对土壤多酚氧化酶活性的影响是相反的（图2），从变化趋势上来看，秸秆处理（NPKS）提高了土壤多酚氧化酶活性，主要是由于秸秆施用提高了土壤有机质的含量，降低了土壤容重（表1），为微生物活动提供良好条件，促进微生物对多酚氧化酶的分泌，同时较高的有机物质为多酚氧化酶提供大量有效底物，进而提高土壤多酚氧化酶活性[18-19]。相反，有机粪肥（NPKM）降低了土壤多酚氧化酶的活性，这与李明松的研究结果相同[10]。有机粪肥与秸秆投入同样提高了土壤有机质含量，降低土壤容重（表1），但由于有机粪肥中含有较高的腐殖物质，进入土壤后与土壤混合可以提高土壤腐殖化程度，致使土壤多酚氧化酶活性与土壤有机物的腐殖化程度成负相关关系[20]。因此，有机粪肥的投入在一定程度上抑制了土壤多酚氧化酶的活性。多酚氧化酶在土壤酚类化合物转化中发挥重要作用，土壤酚类化合物如果得不到转化，将对土壤和水体造成污染，所以，根据本研究的研究结果，有机粪肥虽然改善了土壤理化性质，但是存在降低土壤对酚类氧化物分解能力的环境风险，对此今后应开展深入研究。

土壤过氧化氢酶可催化土壤中酚类和胺类化合物的氧化分解[7]，而尿素就是胺类化合物的一种，因此，过氧化氢酶在土壤氮转化过程中同样发挥重要作用。过氧化氢酶是存在于微生物体内和微生物分泌的氧化还原酶，秸秆和畜禽粪可以通过增加土壤有机质含量，促进微生物活性和数量的方式提高土壤过氧化氢酶活性（图3）[21]。

硝化还原酶与亚硝酸还原酶是反硝化过程的主导酶[22]，硝酸还原酶活性主要受土壤narG和napAB基因控制，亚硝酸还原酶活性主要受nirK和nirS基因控制[23]。本研究中有机物料部分替代化肥处理（NPKS、NPKM）提高了土壤中硝化还原酶的活性和亚硝酸还原酶的活性（图4, 5），主要原因与有机物料投入对反硝化微生物和功能基因的影响有关。马龙等人[24]的研究结果指出，秸秆与畜禽粪肥部分替代化肥显著提高了土壤反硝化基因narG、napAB、nirK及nirS的基因丰度。土壤中的硝酸盐还原微生物偏爱在富含有机质的环境中生存[25-26]，秸秆和畜禽粪便通过提升土壤有机质含量（表1）提高了土壤中硝酸盐还原微生物的活性，进而提高了土壤中硝化及亚硝酸还原酶的活性。另外，研究发现，土壤nirK和nirS的基因丰度与土壤pH呈显著正相关关系[27]，本研究中，与单施化肥处理（NPK）相比，秸秆与有机粪肥处理（NPKS、NPKM）土壤pH升高（表1），由此提高了土壤亚硝酸还原酶的活性。由于硝酸还原酶与亚硝酸还原酶是反硝化过程的主导酶，可以推测有机部分替代化肥在应用过程中存在加剧NO和N2O排放的负面环境效应，Wu和 Das等人的研究结果印证这一推测[28-29]。

土壤脲酶、多酚氧化酶及过氧化氢酶在玉米生育期内均呈先升高后降低的趋势变化，这与玉米不同生育时期的温度变化有关。苗期及成熟期土壤温度较低，因此酶活性相对较低。另外马志良等人[29]研究发现，根际土壤多酚氧化酶和过氧化氢酶活性显著高于非根际土壤，说明根际活动及其分泌物显著影响土壤多酚氧化酶和过氧化氢酶活性。玉米从苗期开始根部活动逐渐增强，分泌物逐渐增加，而接近成熟期阶段，根部活动降低，分泌物减少。因此，土壤多酚氧化酶和过氧化氢酶活性呈先升高后降低的趋势（图2, 图3）。而脲酶活性在受温度影响的同时还受到反应底物浓度的影响。本研究中，苗期和拔节期（追肥后）土壤脲酶均显著上升（图1），主要原因是尿素的施入为土壤脲酶提供了反应底物，进而提高了脲酶活性。硝酸还原酶与亚硝酸还原酶的活性在玉米生育期内的变化与其反应底物浓度是相关的，尿素进入土壤后在脲酶的作用下水解释放NH4 + ，NH4 + 经硝化作用转化成为NO3−，为硝酸还原酶提供反应底物，因此，硝酸还原酶的活性在每次尿素施入后呈上升趋势（图4），而伴随着尿素逐渐水解，NH4 + 逐渐降低，硝化作用逐渐减弱，NO3−来源减少，硝酸还原酶所需底物逐渐减少，致使硝酸还原酶活性在追肥结束后呈逐渐下降趋势。NO3−在硝酸还原酶的作用下转化成NO2−，是亚硝酸还原酶的反应底物，伴随着硝化作用的进行，NO2−逐渐产生，因此在玉米生育期内，土壤亚硝化还原酶呈上升趋势（图5）。

与不施肥处理（CK）相比，长期单独施用化肥（NPK）对土壤脲酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、硝酸还原酶及亚硝酸还原酶活性的提升均表现出一定的促进作用，这同样与化肥投入促进玉米根系活性，增加根系分泌物，为酶提供反应底物的能力增加密切相关[30]。

本研究结果发现，有机物料部分替代化肥的施肥方式存在着降低土壤多酚氧化酶，提高土壤硝化还原酶和亚硝酸还原酶活性从而加剧N2O排放的负面效应的可能性。诸多研究也发现有机物料添加加剧了土壤N2O的排放[24, 31]，印证了这一推测。因此，在未来的研究中，需探究更为合理的有机肥应用方式或配施措施，以降低有机物料分解带来的环境风险，为绿色农业和可持续发展战略的实施做出贡献。