菊花花部类胡萝卜素差异积累的转录调控机制
菊花花部类胡萝卜素差异积累的转录调控机制
【摘要】： 类胡萝卜素是一类重要脂溶性色素的总称,是由异戊二烯骨架构成的C_(40)或C_(30)萜类化合物,其广泛分布于自然界中,是决定植物花和果实呈色的重要色素物质之一。尽管类胡萝卜素代谢研究已取得了很大的进展,但是关于类胡萝卜素代谢调控的分子机制还不够清晰。菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是中国传统名花,也是闻名世界的四大鲜切花之一,花色是菊花最重要的品质性状,花色品质的优劣直接影响其观赏价值和经济价值。类胡萝卜素是决定菊花黄色、泥金色和橙色系呈色的关键色素物质,其还能够与花青素共同决定鲜红色、复色和双色系菊花品种的呈色,因此,研究菊花类胡萝卜素代谢及调控具有重要的理论价值和实践意义。本研究以菊花花色芽变突变体‘兼六香’系列(该系列品种重瓣性较高,头状花序上仅含有舌状花,用于探究不同色系菊花舌状花类胡萝卜素差异积累的原因)及托桂型菊花‘东篱粉桂’(用于探究同一菊花品种舌、管两类小花类胡萝卜素差异积累的机制)为材料,在厘清其色素背景的前提下使用一系列分子生物学技术初步解析了类胡萝卜素在不同色系菊花舌状花之间及同一头状花序上舌、管两类小花之间差异积累的原因,探究了菊花类胡萝卜素代谢的转录调控机制。获得的主要结果如下:(1)为探究类胡萝卜素在不同色系菊花品种舌状花之间差异积累的原因,以传统菊花品种‘兼六香’的白、粉、黄、红4个花色突变体为材料,对其不同发育阶段舌状花的类胡萝卜素含量、组分及质体超微结构的动态变化进行分析比较,发现在菊花头状花序发育初期(S1)4个花色品种舌状花中的类胡萝卜素组分及质体结构完全相同,类胡萝卜素主要包括紫黄质、叶黄素及β-胡萝卜素,储存于前质体和未成熟的叶绿体中。随着头状花序的发育,‘兼六香白’、‘兼六香粉’中的叶绿体发生降解,前质体产生了囊泡结构,舌状花仅积累微量的类胡萝卜素;‘兼六香黄’、‘兼六香红’中的前质体和叶绿体都转化成有色体结构,能够大量积累叶黄素、叶黄素的同分异构体及叶黄素的衍生物。利用比较转录组学结合基因表达分析发现与有色体转化有关的Cm PAPs(Cm Pg-1、Cm PAP10、Cm PAP13)以及参与类胡萝卜素分支代谢的Cm LCYE、类胡萝卜素降解的Cm CCD4a-2在四个色系间存在差异表达,推测其共同影响菊花舌状花中类胡萝卜素的积累。此外,利用WGCNA结合相关性分析共筛选到了9个与类胡萝卜素代谢相关的转录因子:Cm MYB305(同Cm MYB19-1)、Cmb ZIP61、Cmb HLH62、Cm AGL24、Cm RAD3、Cm NAC1、Cm RAP2-3、Cm MYB29(同Cm MYB4)、Cm IAA,这些转录因子可能通过调控类胡萝卜素代谢及与质体发育相关结构基因的表达从而影响菊花舌状花中类胡萝卜素的积累。(2)基于前期获得的菊花品种‘兼六香’的转录组数据库,结合WGCNA分析以及同源基因挖掘,共筛选出11条可能参与菊花舌状花类胡萝卜素代谢转录调控的R2R3型MYB转录因子。利用双荧光素酶点对点分析筛选出起转录激活作用的候选转录因子Cm MYB21-1,其隶属于R2R3型MYB转录因子家族第21亚家族,与猴面花El RCP1的亲缘关系更近。瞬时过表达Cm MYB21-1后菊花舌状花大量积累类胡萝卜素,且除了类胡萝卜素代谢相关结构基因Cm DXS1、Cm GGPPS、Cm PSY2、Cm PDS、Cm LCYB、Cm LCYE、Cm CYP97C(Cm CHYE)外,与有色体分化发育密切相关的Cm PAPs(Cm Pg1、Cm PAP10、Cm PAP13)的表达量也显著上升,此表明Cm MYB21-1可能同时影响着菊花舌状花类胡萝卜素的合成和存储。同时,在毛华菊中稳定过表达Cm MYB21-1后叶片类胡萝卜素含量显著上升,此进一步表明Cm MYB21-1对于类胡萝卜素的代谢具有明显的激活作用。此外,酵母双杂交显示Cm MYB21-1能够直接与菊花花青素苷激活因子Cm MYB6发生互作,推测该转录因子还可能通过蛋白互作间接影响菊花花青素苷的积累。(3)以托桂型菊花品种‘东篱粉桂’为主要试验材料,利用高效液相分析法结合质谱分析(HPLC-MS/MS)对舌、管两类小花中类胡萝卜素的含量及组分进行分析鉴定发现,管状小花积累大量类胡萝卜素,主要包括叶黄素、环氧叶黄素及其衍生物,而舌状小花几乎不积累类胡萝卜素,同时这种积累模式在其他不同色系菊花品种及菊花近缘野生种中同样存在。利用比较转录组及基因表达分析发现,Cm CCD4a-2是决定类胡萝卜素在托桂型菊花品种‘东篱粉桂’中差异积累的关键结构基因。以Cm CCD4a-2的启动子为饵,利用酵母单杂交筛库筛选发现Cm AP3、Cm UIF1是Cm CCD4a-2上游潜在的转录因子,然而双荧光素酶试验显示俩者无法独立激活Cm CCD4a-2的转录。利用酵母双杂交、双分子荧光互补及酵母三杂交试验发现Cm PI可作为中间桥梁蛋白连接Cm AP3和Cm UIF1形成Cm AP3-Cm PI-Cm UIF1的转录因子复合体,其对于Cm CCD4a-2的转录具有明显的激活作用,从而使得类胡萝卜素在菊花两类小花中差异积累。综合以上研究结果,本研究初步解析了类胡萝卜素在菊花头状花序中差异积累的代谢及转录调控机制:一方面,参与类胡萝卜素分支代谢的Cm LCYE、类胡萝卜素降解的Cm CCD4a-2及与有色体转化有关的Cm PAPs(Cm Pg-1、Cm PAP10、Cm PAP13)共同决定类胡萝卜素在不同色系菊花舌状花中的差异积累。而R2R3型MYB转录因子Cm MYB21-1作为上游转录激活因子能够直接或间接的激活下游关键结构基因的表达从而促进菊花舌状花类胡萝卜素的合成和积累;另一方面,Cm CCD4a-2是决定类胡萝卜素在托桂类菊花品种‘东篱粉桂’头状花序上舌、管两类小花中差异积累的最为关键的结构基因。而在菊花舌状花中大量存在的上游转录因子复合体Cm AP3-Cm PI-Cm UIF1对于关键结构基因Cm CCD4a-2的转录具有明显的激活作用,从而使得类胡萝卜素在菊花两类小花中差异积累。本研究通过解析类胡萝卜素在不同色系菊花品种舌状花之间及同一头状花序上舌、管两类小花之间差异积累的原因,挖掘出了一批决定菊花类胡萝卜素代谢的关键基因资源,包括关键的结构基因及起调控作用的上游转录因子,并系统构建了上下游调控网络,为利用基因编辑手段定向改良菊花花色奠定基础,同时为丰富植物类胡萝卜素代谢的转录调控机理提供依据。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2022
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