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棉花分枝GhMAX2基因的克隆与功能研究

花匠小妙招
2024-08-26 06:50

聊城大学硕士学位论文聊城大学硕士学位论文 PAGE PAGE VI 摘要棉花是世界上最重要的农作物之一，其主副产品都有很高的利用价值。它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，并且还是纺织、精细化工的原料和重要的战略物资。但是，棉花自身具有由果枝、营养枝和赘芽组成的复杂的分枝模式和顶芽无限生长的生长习性，导致必须对其进行一定程度的整枝和打顶，耗费了大量的劳动力。因此，研究棉花分枝控制有着非常重要的意义。本课题主要在实验室已有基础上，对 GhMAX2 棉花分枝相关的基因做了进一步的研究。 GhMAX2 基因隶属 F-box/LRR 蛋白家族，与水稻的 D3 基因、豌豆的 RMS4 基因以及拟南芥的 MAX2 基因同源性最高。这类基因参与了植物激素独角金内酯（Strigolactone）的信号传导途径，该激素在植物根部合成，向上运输，抑制地上部分侧枝的伸长。GhMAX2 基因组 DNA 序列总长 2463bp，5’UTR 区长为 56bp，3’UTR 区长为 298bp，开放阅读框长度为 2109bp 核苷酸，编码 702 个氨基酸，无内含子。通过对 GhMAX2 序列的克隆，我们获得了两条高度同源的序列，它们之间存在 31bp 不同的碱基序列和 15 个不同的氨基酸序列，我们分别命名为 GhMAX2a 和 GhMAX2b。将 GhMAX2a/b 与其它功能特征相似的蛋白进行氨基酸序列分析，如水稻的 D3、豌豆的 RMS4 以及拟南芥的 MAX2，发现在 GhMAX2a/b 的 N 端和 C 端分别存在 F-box 蛋白域和 LRRs 蛋白域。为了研究预测 MAX2 蛋白之间的进化关系，选取了一些低等植物、单子叶植物、双子叶植物中相关蛋白质做进化树分析，结果表明 GhMAX2a/b 与蓖麻的遗传距离最近，这表明我们从陆地棉中克隆出了 MAX2 的同源基因。为了进一步研究该基因对植物分枝的调控功能，构建 CaMV35S 启动子驱动的植物表达载体 GhMAX2CDSa/b-121，转化拟南芥 max2 突变体。通过对拟南芥转化结果的数据调查，发现转化 GhMAX2CDSa/b-121 载体的突变体表型介于野生型和突变体之间，得到了部分回补。通过此结果说明 GhMAX2 基因与拟南芥 MAX2 基因在功能上是一样的，即在调控植物分枝方面起着重要的作用。同时为了验证同源基因 GhMAX2CDSa 和 GhMAX2CDSb 的表达水平是否相同，构建了 pGADT7-GhMAX2a/b 载体并转入大肠杆菌进行测序，测序结果表明 GhMAX2b 的表达水平大约是 GhMAX2a 的 3 倍。为了验证 GhMAX2 是否与 MAX2/RMS4/D3 一样处在独脚金内酯的传导途径上，通过用不同浓度的 GR24 处理棉花的幼苗并处理不同的时间，然后通过在转录水平上通过 RT-PCR 来检测 GhMAX2 的表达水平，结果表明无论用多高浓度或者低浓度的 GR24 处理，还是长时间处理或者短时间处理，GhMAX2 的转录水平没有明显的变化，即 GhMAX2 对 GR24 是不响应的。构建了 pGADT7-GhMAX2 、 pGADT7-F-box 、 pGADT7-LRRs 和 pGBKT7-ASK1 进行酵母双杂交实验，构建了 Flag-GhMAX2、 Myc-ASK1 和 Myc-OSK15 进行免疫共沉淀（Co-IP)实验，共同验证 GhMAX2 与 ASK1 （SKP1 类似结合蛋白）的相互作用，结果表明 GhMAX2 能够与 ASK1 发生相互作用，即 GhMAX2 能够与 SKP 或者其它蛋白形成 SCF 复合体。通过以上的结果，我们可以得出棉花 GhMAX2 基因能够编码抑制植物侧向分枝的 MAX2 功能异构体。本课题对于 GhMAX2 基因功能的深入分析以及棉花株型在农业生产棉花产量的变化中所起的作用，正在进行进一步的分析。关键词：陆地棉，棉属，MAX2，分枝, 独脚金内酯 ABSTRACT Cotton is one of the most important crops in the world. It’s products are very valuable. It is not only an important oil crop, but also an important fiber crop.What’s more, it has a high protein content. Therefore, cotton is supposed to be the best raw materials