红花草莓花瓣呈色相关基因表达分析及花色分子标记
红花草莓花瓣呈色相关基因表达分析及花色分子标记
【摘要】： 草莓属植物均开白花。红花草莓为属间杂种(Fragaria×Potentilla),是一种新型的观赏兼食用的多年生草本花卉。花色是决定红花草莓观赏价值的重要性状,花瓣的颜色覆盖了整个红色系。花色的形成不只是花青素显示的结果而是涉及到很多其他的因素诸如细胞形状、辅色素和液泡pH等。花青素苷是红花草莓花瓣的主要色素,本研究拟对红花草莓花青素苷合成途径相关基因表达与花青素苷含量的关系进行分析,并开发与红色花性状相关的分子标记,这对了解红花草莓花青素苷合成途径的机制和分子育种具有重要意义。本研究以红花草莓杂交后代为试材,通过花瓣解剖结构观察,花瓣主要呈色色素测定,花青素苷含量分析,花瓣pH值和抗氧化活力测定,系统研究了红花草莓花色形成的物质基础和理化因素。进一步基于RNA-seq技术测定红花草莓品种‘四季红’的花瓣三个发育阶段(‘L’,‘Z’和‘D’)的转录组,利用qRT-PCR研究了花青素苷合成途径相关的结构基因和转录调控基因在红花草莓不同花色中的转录水平变化,及其与花青素苷含量的相关性。同时,以转录组序列信息结合SSR标记技术,筛选与红花草莓花色性状相关的分子标记。研究结果为红花草莓分子标记辅助育种奠定理论基础和实践依据。主要研究结果如下:利用色差仪和比色卡对红花草莓杂交后代5种不同花色,红色、深粉色、粉色、浅粉色和白色进行了测量。结果表明,a~*(红度)与b~*(黄度)的相关性不明显,而L~*(亮度)与a~*(红度)和C~*(彩度)均呈明显的负相关关系;使用扫描电镜观察红花草莓花瓣面表皮细胞结构,发现红色、深粉色和粉色花瓣表皮细胞形状都呈无规则镶嵌型,细胞表皮趋于平缓。而白色花瓣和浅粉色花瓣表皮细胞形状为球(卵)形凸起;采用特征显色反应和紫外-可见光谱,初步确定了红色系花瓣中的呈色色素类型是花青素苷和黄酮类,两种色素复合形成花色。花青素作为主要的呈色色素,黄酮类作为协同着色色素。白色花瓣中的呈色色素类型为黄酮类化合物,花瓣中均不含胡萝卜素;采用徒手切片法,观察花瓣解剖结构,发现红花草莓花瓣纵切面分为上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮,具有典型结构特征;pH示差法测定花瓣中花青素苷含量,发现随着花瓣红色饱和亮度逐一递减花青素苷含量也随之降低。五个花色中,红色和深粉色花具有更强的抗氧化活性。基于RNA-seq文库,筛选得到表达差异不显著的候选内参基因BZIP、TIM、TUB、EF1a、AP2和TIP41。采用geNorm、Normfinder、BestKeeper三种软件和比较△Ct法分析各候选内参基因在不同试验条件下基因表达的稳定性。结果表明,不同的统计分析方法得到的结果也有所不同。在所有样品中,使用geNorm和BestKeeper统计分析结果的稳定性前两名均是AP2与TIP41;在不同花色中,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper和△Ct统计分析结果的稳定性前两名也均是AP2与TIP41;在不同倍性中,使用NormFinder、BestKeeper和△Ct统计分析结果的稳定性前两名均是AP2与EF1a;从四款软件的整体分析结果中,发现稳定性最高的为AP2,其次是TIP41。通过geNorm配对系数V值,确定了准确定量实验结果所需的最适内参基因数目为2个,内参的最佳组合为AP2+TIP41。通过RNA-seq,利用qRT-PCR分析红花草莓花瓣花青素苷合成途径上的20个结构基因和2个转录调控基因在不同花色中基因表达量,同时建立了基因表达量与总花青素苷含量的线性回归方程,分析其相关性。结果表明,大部分结构基因的表达量与总花青素苷含量呈正相关,只有FpFLS(R~2=0.001)、FpANR(R~2=0.0069)、FpGT1(R~2=0.018)、FpUGT75C1(R~2=0.276)的表达量均与总花青素苷含量的相关性不显著。2个MYB转录因子基因中,FpMYB10在不同花色的表达量与总花青素含量呈极显著正相关,在花青素苷合成过程中正向调控。但FpMYB6在不同花色的表达量与总花青素含量呈负相关,在花青素苷积累过程中负向调控。基于RNA-seq已知基因中的SSR,分析红花草莓转录组测序中获得的genic-SSRs的特征。发现红花草莓转录组中SSR位点的类型丰富,从139,292个转录本中鉴定出12,077个unigenes,共发现14,264个SSR位点。其中有1823条unigenes含有多于1个SSR位点,有758个SSR位点以复杂的形式存在。在所有重复类型中,SSR长度范围为10至228bp,平均长度为16.58bp。由单碱基重复至六碱基重复均有分布,每个重复类型所含的数量差异较大。在鉴定的SSR中,搜索到了176个基序序列类型,最丰富的重复序列类型是二核苷酸型(GA 21.33%)。在编码区的三核苷酸重复序列中,AGG/CCT基序是频率最高的。二核苷酸重复序列中,AC/GT基序是红花草莓中最常见的。基于转录组深度测序开发了4个特异性SSR分子标记,这些标记可有效标记红色系花色性状,在红花草莓幼苗期即可有效区分开红色系花实生苗,可有效缩短红花草莓的育种周期。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
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